凝胶色谱柱使用注意事项.ppt
Sephadex LH-20,中药生物技术S0620336刘利,基本内容 1结构 2性质 3应用原理使用方法 1一般使用过程 2溶剂选择 3再生方法 4污染处理方法注意问题,基本内容,1.Sephadex LH-20结构特点Sephadex LH-20是Sephadex G-25经羟丙基化处理后得到的产物。葡聚糖凝胶中的葡萄糖部分与羟丙基结合成醚键形式。亲脂性的羟丙基是同时具备吸附性层析和分子筛功能的独特层析介质。,交联葡聚糖凝胶的化学结构,2 Sephadex LH-20性质,交联度小，机械强度低，不耐压，溶胀性大具亲脂性和亲水性，水及有机溶剂中都能应用可用于分子筛层析、吸附层析和分配层析 应用范围广泛，适合用有机溶剂分离嗜脂性分子载样量高，极少需要再生,主要性能参数分离范围（球蛋白）100-4000颗粒大小（微米）20-150应用范围 胆固醇，脂肪酸，激素，维他命，天然产物PH稳定性 2-13最高流速（厘米小时）500,3应用原理凝胶层析的分子筛原理,l 分子大小不同混合物上柱；2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开：4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中,吸附原理吸附：范德华力或产生氢键 反相分配原理分配：极性与非极性溶剂组成的混合剂（反相溶剂）中起到反相分配的效果,使用反相溶剂洗脱，极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。,使用方法,制备凝胶悬浮液 装柱平衡 上样洗脱 再生污染处理,制备凝胶悬浮液,Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时。在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器,将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。,使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25%，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。,LH-20在不同溶剂中的溶胀性能,溶剂溶胀体积 溶剂 溶胀体积 ml/g干胶 ml/g干胶二甲亚砜4.2-4.4 乙醇 3.2-3.6吡啶 4.0-4.3 异丙醇 3.1-3.5水 3.8-4.2 四氢呋喃3.1-3.5甲醇 3.7-4.2 二氯乙烷3.5-4.0丙醇 3.4-3.8 甲苯,装柱,将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。柱装得不好往往造成洗脱区带加宽，甚至使一些本来可以分开的区带重叠。如装柱时的操作压力太大，会使凝胶床压得太实，从而降低流速。,一般是在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使其自然沉降。如此连续操作，可以得到一个均匀的柱床。,平衡,新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用35倍体积的缓冲液在恒压下流过床。上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止。如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器的位置，如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。,上样,一般要求样品粘度小于0.01Pas（帕斯卡.秒），这样才不致于对分离造成明显影响。上样量视被分离物的结构性能的差异而定差异大，可大；差异小，应小。样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好，但过少的样品量会造成设备和器材的浪费，降低工作效率，还会造成样品稀释。,。,洗脱,所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。洗脱流速应根据情况而定，最大张性流速约12cm/min（反压1.5ba），建议流速为1-10cm/min。流速不宜过快且要稳定。洗脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗粒的胀缩引起柱床体积变化或流速改变。,溶剂的选择,主要考虑能溶解样品、湿润凝胶、不腐蚀色谱仪、纯度高、毒性低、溶解性能好，能溶解多种高分子、粘度尽可能低。适用溶剂：满足上述条件，根据分离 要求选择即可，如：水 DMF 丙酮 乙醇 乙酸乙酯 甲醇 氯仿 THF 正丁醇 二氯乙烷常用溶剂：水甲醇丙酮乙酸乙酯 二氯甲烷 甲醇-水 氯仿-甲醇,用低级醇为溶剂时，对芳香族、杂环族化合物仍有吸附作用。但用氯仿时则可去除对上述化合物的吸附作用，而对含羟基与羧基的化合物却有吸附作用。,再生方法,凝胶再生通常是先用2-3个柱体积的洗脱液进行清洗，如更换洗脱液，则需要重新平衡 在洗脱过程中，所有组分一般都可被洗脱下来，所以装好柱后，可反复使用，无需特殊的再生处理。,多次使用后，凝胶颗粒可能逐渐沉积压紧，流速变慢。这时只需将凝胶自柱内倒出，重新填装。或使用反冲法，使凝胶松散冲起，然后自然沉降，形成新的柱床，这样流速会有所改善。,污染处理方法,Sephadex LH20柱子被弄脏了，大多数情况下是由于样品没滤,将柱头堵住,或由于样品的死吸附(一般很少发生),使柱子的柱头部分污染。一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去,具体做法很简单,只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起,倒掉即可。,如果柱子整个被污染,若是Sephadex LH-20用作反相被污染，办法如下：依次用水,NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子。,因为是整个柱子被污染，所以污染物一定不会完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，污染物一定会只在柱头部分），所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。NaOH-NaCl水溶液配法：8g NaOH,30g NaCl，1000ml水。,保存方法,暂时不用时可水洗-含水醇洗（醇的浓度逐步递增）-醇洗，最后泡在醇中贮于磨口瓶中备用。如长期不用时，可以在以上处理基础上，减压抽干，再用少量乙醚洗净抽干，室温充分挥散至无醚味后，60-80度干燥后保存。,注意问题,1装柱操作压力2样品浓度及上样量3洗脱流速4样品及溶剂处理5鞣质易死吸附，黄酮分离效佳6保存加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块,THANKYOU,
