凝胶电泳应用于糖蛋白的分离鉴定.ppt
二维电泳应用于糖蛋白的分离鉴定,目 录,糖蛋白,1,糖基化,2,凝胶电泳分离纯化技术,3,基于PAS反应的染色方法,4,糖蛋白（glycoprotein）,膜蛋白中的糖,膜蛋白分子中的糖,这些寡糖链常常是具分支的杂糖链，不呈现重复的双糖系列，一般由2-10个单体（少于15）组成，未端成员常常是唾液酸或L-岩藻糖。,糖蛋白的结构,单糖的种类葡萄糖(Glu)半乳糖(Gal)甘露糖(Man)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)岩藻糖(Fuc)N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)N-乙酰神经氨酸(NeuAc),连接方式,糖蛋白的结构,糖基化,糖基化 是蛋白质翻译后修饰最重要的方式之一，是必需的生理过程，对蛋白质生物学功能的正确发挥起着至关重要的作用。糖蛋白的形成是糖基化的一种表现形式,糖基化,生物活性,折叠,溶解度,半衰期,抗原性,蛋白质,糖链,糖蛋白,分离纯化及鉴定是糖蛋白研究的重要步骤,糖蛋白的分离纯化方法,Capillary electrophoresis,毛细管电泳,MLC,多维液相色谱,electroblottillg,电印迹技术,gelelectrophoresis,凝胶电泳,电泳技术的基本原理,电泳：带电粒子在电场中的定向移动。,等电聚焦(Isoelectro focusing IEF),原理 Pr为两性电解质，不同Pr其aa的数量、种类及占比例不同，因此pI不同，pI范围窄且净电荷为零，因此依pI分离Pr。EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度(连续的,稳定的,线性的pH)。,原理 当Pr在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为零，不再移动。如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极会重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。只要凝胶中的pH梯度范围足够窄。便可将pI相近的Pr分开，EF是电泳技术中分辨率最高的技术。,等电聚焦(Isoelectro focusing IEF),等电聚焦(Isoelectro focusing IEF),返回,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate(NH4)2S2O3，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2,C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。,电泳过程示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,插入梳子,聚丙烯酰胺凝胶电泳,加缓冲液,加 样,聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳,剥胶,聚丙烯酰胺凝胶电泳,标准Marker蛋白的电泳图谱,聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶电泳,可直接在胶上对糖蛋白进行酸水解或酶解后进行后续的鉴定分析或糖链的结构分析。,可以同时分离多个复杂混合物,优势,双向凝胶电泳（二维电泳）第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状。,二维电泳,胶性 PH9中电加解入质了溶双液 PH3,加上电场后建立稳定PH梯度,蛋白质溶液加入，建立电场,染色后，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开,第一向等电聚焦,PI逐渐降低,等电聚焦胶放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上,第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量逐渐降低,PI 逐渐降低,双向凝胶电泳示意图,二维电泳,染色,二维电泳,1,基于PAS反应的染色方法,3,GelCode糖蛋白染色试剂盒,2,硼酸根荧光染料,二维电泳中糖蛋白的染色方法,基于PAS反应的染色方法,PAS-periodic acid-Schiffs base method(高碘酸/过碘酸-席夫式碱方法)原理 在过碘酸的作用下，糖蛋白中糖链上相邻两个碳原子上的羟基被氧化成醛基，醛基再与带有紫外或荧光基团的氨基形成席夫式碱，在紫外或荧光灯下检测即可。席夫式碱N原子和C原子双键结合的一类化合物,基于PAS反应的染色方法,酸性品红,丹酰肼荧光试剂,丹磺酰甘氨酰肼荧光试剂,Pro-Q Emerald类染料,过碘酸作用显紫红色对还有唾液酸的糖蛋白灵敏染色7天灵敏度低g,高碘酸作用醛基与胺基反应形成腙染色2天灵敏度低40 ng反应条件苛刻,酸性条件灵敏度低10-20 ng糖蛋白染色专一性高，适用于未知样品的鉴定分析和样品纯度的鉴定,美国新发明的一种糖蛋白鉴定试剂盒反应条件温和灵敏度极高糖基化位点表达程度图谱荧光标记物结构尚未公开,Thank You!,
