凝胶电泳及分配层析.ppt
分配层析,制作人：聂世宁,一 概念 分配层析是利用各组分在两相中分配系数的不同，而使各组分分离的层析方法。二 原理 由于不同溶质有不同的分配系数，移动速率不同因此可以达到分离的效果。分配系数与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力等条件的影响，所以不同的物质在不同的条件下，其分配系数各不相同。在层析条件确定后，某溶质在确定的层析系统中的分配系数是一常数。分配系数分配色谱的狭义分配系数表达式如下：K=CsCm=（Xs/Vs）（Xm/Vm）式中Cs代表组分分子在固定相液体中的溶解度，Cm代表组分分子在流动相中的溶解度。,三 过程在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸附一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上；另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相向流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动下流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。,四 应用 分配层析包括纸层析、薄层层析和分配气相层析等方法。一 纸层析 在纸层析中的流动相是指层析液，在毛细拉力作用下，层析液能不断由下向上流动。固定相是指被吸附在滤纸纤维之间的水分。由于纤维素上的羟基具亲水性使这部分水束缚在纤维素周围，不易扩散而成为固定相。在层析过程中，当层析液在毛细拉力作用下，上升流经色素滤液细线时，滤液细线上的色素就相继融入层析液，随着层析液上升，并发生在分配，即有一部分色素从层析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系数的不同，那些分配系数大的色素分子，随层析液向上移动得快，形成的色素带集中在滤纸的上部；而分配系数小的色素分子，随层析向上移动得慢，形成的色素带集中在滤纸的下面。,纸层析设备简单，操作简便，所需样品少，分辨能力一般能达到要求，在实验室用于各种组分的分离并进行定性定量分析。但是其展开时间长，分离量小，不适用于大量组分的工业划分离生产，而且作为流动相的有机溶剂可能引起酶的变性失活。二 薄层层析 薄层层析是将作为固定相支持物均匀的铺在支持板（一般用玻璃板）上，成为薄层。把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，利用各种组分的移动距离不同，而使各组分分离。如果支持物是固定吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，层析时是依据吸附力的不同使组分分离，则称吸附薄层层析；如果支持物是纤维素、硅藻土等，层析时主要依据分配系数的不同而使组分分离，则称分配薄层层析。薄层层析的展开时间段，分辨率比纸层析高10100倍，既可作分析用分离0.01ug的微量样品又能做制备用分离500mg甚至更多的样品，因此薄层可以规格化制备。然而薄层层析的重现性比纸层析差，对酶等生物大分子的分离效果不理想。,凝胶电泳,概念凝胶电泳（Gel electrophoresis）是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、形状、等电点等分子的技术。凝胶电泳通常用于分析用途。但也可以作为制备技术，如在使用质谱(MS)、PCR、克隆、DNA测序、免疫印迹等检测之前用于提纯分子。基本原理及过程,琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D半乳糖和3,6脱水L半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是13，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，,这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖（62 C时熔化，因此其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：1）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。2）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。,操作流程准备干净的配胶板和电泳槽 注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.52%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。适合的电泳缓冲液,常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 DNA样品的纯度和状态是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。,DNA的上样正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。Marker的选择DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。TIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择DNA/HindIII或者DNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。,凝胶的染色和观察实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。TIANGEN公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。从琼脂糖中回收DNA片段电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法 胶回收注意事项：将电泳槽用ddH2O反复清洗干净，倒入新鲜配制的灭菌电泳缓冲液；根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板；切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶；要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤；熔胶要完全。,聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)2 N,N-methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。溶液的pH对聚合作用是重要的，因为过低pH没有足够的碱基加速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝胶时，在加过硫酸铵之前，混合物必须抽去空气。核黄素催化的聚合作用，常用于制备浓缩胶，因为这样制得的凝胶孔度要大些。核黄素在光照射下及有微量氧存在时，产生自由基使Acr发生聚合作用。,操作流程1.配制SDS聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂2SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制3用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。染色12小时或过夜。4.换脱色液脱色，需310小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。注意事项制备胶所使用的玻璃板或玻璃管均需要洁净并经过干燥方能使用制备胶时，小心避免混入气泡，为此再将各种所需比例的贮存混合后，应进行抽气处理。,应用凝胶电泳被广泛用于分子生物学、遗传学和生物化学：1.大的DNA或者RNA分子通常利用琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）分离，也可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。2.蛋白质的凝胶电泳通常在加入十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行（SDS-PAGE），或者非变性凝胶电泳，或二维电泳。3.毛细管电泳 4.酶谱法（zymography）5.变性梯度胶凝电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）,琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。,
