凝胶层析法分离蛋白质.ppt

凝胶层析法分离血红蛋白和溴酚蓝,【目的】,掌握凝胶层析的基本原理学习利用凝胶层析法分离生物大分子和小分子的实验技能,【原理】,凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。,凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。,凝胶层析,带网孔的葡聚糖珠,小分子进入葡聚糖珠内,大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出,凝胶层析过程示意图,凝胶层析过程示意图,小分子,大分子,凝胶基质,凝胶珠,总结：相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。,【实验器材】,层析柱洗脱装置试管等普通玻璃器皿,【实验试剂】,待分离样品：1。鸡血红蛋白：取新鲜抗凝全血5ml，于2000r/min离心10min，弃血浆，用三倍于血球体积的0.9Nacl溶液洗血球（颠倒混匀）。离心弃去上清液，重复12次，至上清液清亮为止。于血球中加入10倍体积的蒸馏水，混匀，使血球破碎，过滤，即得血红蛋白溶液。2。1mg/ml溴酚蓝溶液(待分离样品老师已准备好)葡聚糖凝胶 Sephadex G-25洗脱液：0.2mol/L NaCl缓冲液,【操作方法】,一、凝胶的处理Sephadex G-25干粉置于蒸馏水中室温下溶胀3h，沸水浴加热，再用蒸馏水洗涤几次，将不易沉降的细小颗粒随水倾倒（以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速）。洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。（凝胶已处理）,二、装柱A,将层析柱垂直固定在铁架台上，关闭出口，向柱内加入洗脱液约1cm高，若不漏则证明柱完好。B,将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等；用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内，此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱；C,当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝胶完全沉降；D,凝胶柱上始终覆盖一层溶液，凝胶柱用洗脱液流过。,装柱注意事项：（1）装柱前加入1cm洗脱液，检查柱子（2）凝胶装柱要一次完成。（3）柱中的凝胶一定要浸没在洗脱液中。（4）装凝胶的烧杯不能清洗。（看似脏的 东西都是凝胶）。,三、加样与洗脱 先打开下口开关，放出凝胶柱面上的溶液（或吸取，但溶液面不能低于凝胶表面），然后加样，控制流速，使样品渗入凝胶内。本实验样品为：血红蛋白和溴酚蓝混合样品0.75mL(血红蛋白：溴酚蓝=2:1），用移液管滴加在液面下（不能冲起凝胶柱，也不能沿管壁流下），样品下渗至凝胶面时，关闭下口，完成上样，再加一层洗脱液（35cm）。调整洗脱装置使滴入洗脱液滴速率与流出液滴速率一致。,四、收集 用试管收集洗脱液。五、凝胶柱的处理 凝胶用过后，用洗脱液通过柱（23倍床体积）即可。注意：需回收！,注意事项,始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。,思考题,一、为什么溴酚蓝能与血红蛋白在层析柱中能够很好的分开？二、生化实验中常用的凝胶有哪些？各有何特征？,