农药毒理-生物氧化.ppt

第十章 生物氧化,维持生命活动的能量，主要有两个来源:光能（太阳能）：植物和某些藻类，通过光合作用将光能转变成生物能。化学能：动物和大多数的微生物，通过生物氧化作用将有机物质（主要是各种光合作用产物）存储的化学能释放出来，并转变成生物能。,有机物质在生物体内的氧化作用，称为生物氧化。生物氧化通常需要消耗氧，所以又称为呼吸作用。在整个生物氧化过程中，有机物质最终被氧化成CO2和水，并释放出能量。而外源有机物（药物、毒物等）进入机体后，在微粒体氧化酶系的作用下，将发生一系列化学变化并形成一些分解产物或衍生物，此种过程称为生物转化或代谢转化。,生物氧化的特点,1，生物氧化是在生物细胞内进行的酶促氧化过程，反应条件温和（水溶液，pH7和常温）。2，氧化进行过程中，必然伴随生物还原反应的发生。3，水是许多生物氧化反应的氧供体。通过加水脱氢作用直接参予了氧化反应。4，在生物氧化中，碳的氧化和氢的氧化是非同步进行的。氧化过程中脱下来的氢质子和电子，通常由各种载体，如NADH等传递到氧并生成水。,5，生物氧化是一个分步进行的过程。每一步都由特殊的酶催化，每一步反应的产物都可以分离出来。这种逐步进行的反应模式有利于在温和的条件下释放能量，提高能量利用率。6，生物氧化释放的能量，通过与ATP合成相偶联，转换成生物体能够直接利用的生物能ATP。,第一节、生物能及其存在形式,一般的能量形式，如光能（如太阳能）、热能和化学能等，都不能为生物细胞直接利用。光能需要通过光合作用转变成ATP(光合磷酸化)；化学能则需要通过生物氧化转变成ATP（氧化磷酸化）。ATP是能够被生物细胞直接利用的能量形式。,一、生物能和ATP,二、高能化合物,磷酸酯类化合物在生物体的能量转换过程中起者重要作用。许多磷酸酯类化合物在水解过程中都能够释放出自由能。一般将水解时能够释放21kJ/mol（5千卡/mol)以上自由能（G-21kJ/mol）的化合物称为高能化合物。ATP是生物细胞中最重要的高能磷酸酯类化合物。根据生物体内高能化合物键的特性可以把他们分成以下几种类型。,2,氮磷键型,磷酸肌酸,磷酸精氨酸,10.3千卡/摩尔,7.7千卡/摩尔,这两种高能化合物在生物体内起储存能量的作用。,3,硫酯键型,3-磷酸腺苷-5-磷酸硫酸,酰基辅酶A,4,甲硫键型,S-腺苷甲硫氨酸,第二节、线粒体呼吸链和ATP合成,细胞内的线粒体是生物氧化的主要场所，主要功能是将代谢物脱下的氢通过多种酶及辅酶所组成的传递体系的传递，最终与氧结合生成水。由供氢体、传递体、受氢体以及相应的酶催化系统组成的这种代谢途径一般称为生物氧化还原链，当受氢体是氧时，称为呼吸链。,一、线粒体呼吸链的组成,线粒体呼吸链,NADH,NADH是呼吸链组成的第一个成员，主要来自生物大分子代谢过程。,NADH泛醌还原酶,简写为NADHQ还原酶,即复合物I，它的作用是催化NADH的氧化脱氢以及Q的还原。所以它既是一种脱氢酶，也是一种还原酶。NADHQ还原酶最少含有16个多肽亚基。它的活性部分含有辅基FMN和铁硫蛋白。FMN的作用是接受脱氢酶脱下来的电子和质子，形成还原型FMNH2。还原型FMNH2可以进一步将电子转移给Q。NADHQ还原酶 NADH+Q+H+=NAD+QH2,复合体:NADH-泛醌还原酶,铁硫簇Fe4S4结构示意图 铁硫蛋白的Fe-S 中心也许象(a)一样简单,来自于半胱氨酸的四个硫原子环绕着铁原子。其它中心包括无机和半胱氨酸的S原子,如同(b)2Fe-2S 或(c)4Fe-4S 中心.(d)的铁氧还原蛋白有 一个2Fe-2S 中心。,泛醌,（简写为Q）或辅酶-Q（CoQ）：它是电子传递链中唯一的非蛋白电子载体。为一种脂溶性醌类化合物。,辅酶Q的功能,Q(醌型结构)很容易接受电子和质子，还原成QH2（还原型）；QH2也容易给出电子和质子，重新氧化成Q。因此，它在线粒体呼吸链中作为电子和质子的传递体。,泛醌细胞色素c还原酶,简写为QH2-cyt.c还原酶,即复合物III,它是线粒体内膜上的一种跨膜蛋白复合物，其作用是催化还原型QH2的氧化和细胞色素c（cyt.c）的还原。QH2-cyt.c 还原酶QH2+2 cyt.c(Fe3+)=Q+2 cyt.c(Fe2+)+2H+QH2-cyt.c还原酶由9个多肽亚基组成。活性部分主要包括细胞色素b 和c1，以及铁硫蛋白（2Fe-2S）。,泛醌细胞色素c还原酶,细胞色素,简写为cyt.是含铁的电子传递体，辅基为铁卟啉的衍生物，铁原子处于卟啉环的中心，构成血红素。各种细胞色素的辅基结构略有不同。线粒体呼吸链中主要含有细胞色素a,b,c 和c1等，组成它们的辅基分别为血红素A、B和C。细胞色素a,b,c可以通过它们的紫外-可见吸收光谱来鉴别。细胞色素主要是通过Fe3+Fe2+的互变起传递电子的作用的。,细胞色素根据它们吸收光谱不同而分类。,细胞色素c（cyt.c）,它是电子传递链中一个独立的蛋白质电子载体，位于线粒体内膜外表，属于膜周蛋白，易溶于水。它与细胞色素c1含有相同的辅基，但是蛋白组成则有所不同。在电子传递过程中，cyt.c通过Fe3+Fe2+的互变起电子传递中间体作用。,由于QH2是一个双电子载体，而参与上述反应过程的其它组分(如cyt.c)都是单电子传递体，所以，实际反应情况比较复杂。QH2所携带的一个高能电子通过铁硫蛋白，传递给cyt.c，本身形成半醌自由基（QH）；另一个电子则传递给cyt.b。还原型cyt.b可以将QH 还原成QH2。其结果是通过一个循环，QH2将其中的一个电子传递给cyt.c。,细胞色素c氧化酶,简写为cyt.c 氧化酶，即复合物IV，它是位于线粒体呼吸链末端的蛋白复合物，由12个多肽亚基组成。活性部分主要包括cyt.a和a3。,复合体IV的结构,cyt.a和a3组成一个复合体，除了含有铁卟啉外，还含有铜原子。cyt.a a3可以直接以O2为电子受体。在电子传递过程中，分子中的铜离子可以发生Cu+Cu2+的互变，将cyt.c所携带的电子传递给O2。,琥珀酸-Q还原酶,琥珀酸是生物代谢过程（三羧酸循环）中产生的中间产物，它在琥珀酸-Q还原酶（复合物II）催化下，将两个高能电子传递给Q。再通过QH2-cyt,c还原酶、cyt.c和cyt.c氧化酶将电子传递到O2。琥珀酸-Q还原酶比NADH-Q还原酶的结构简单，由4个不同的多肽亚基组成.活性部分含有辅基FAD和铁硫蛋白。,二、氧化-还原电势与自由能的变化,在生物氧化反应中，氧化与还原总是相互偶联的。一个化合物（还原剂）失去电子，必然伴随另一个化合物(氧化剂）接受电子。在线粒体呼吸链中，推动电子从NADH传递到O2的力，是由于NAD+/NADH+H+和1/2 O2/H2O两个半反应之间存在很大的电势差。(a)O2+2 H+2 e-H2O E0=+0.82 V(b)NAD+H+2 e-NADH E0=-0.322 V 将(a)减去(b)，即得(c)式：(c)O2+NADH+2H+H2O+NAD+E0=+1.14 VG=-nF E0=-2 96500 1.14=-220 kJ/mol,呼吸链的电子传递,第三节、氧化磷酸化,NADH或琥珀酸所携带的高能电子通过线粒体呼吸链传递到O2的过程中，释放出大量的能量。这种高能电子传递过程的释能反应与ADP和磷酸合成ATP的需能反应相偶联，是ATP形成的基本机制。,1,ATP酶复合体,线粒体内膜的表面有一层规则地间格排列着的球状颗粒，称为ATP酶复合体，是ATP合成的场所。,二、ATP合成反应-氧化磷酸化,生物氧化的释能反应与ADP的磷酰化反应偶联合成ATP的过程，称为氧化磷酸化。线粒体的离体实验证明，一分子NADH所含的两个高能电子，经过呼吸链传递给O2生成水过程中，生成了3分子的ATP。也就是说，在线粒体呼吸链，每传递2个电子，将消耗一个氧原子（1/2O2），其结果是有3个ADP分子与3个无机磷酸分子作用，生成3分子的ATP。在此反应中，参予反应的磷原子与氧原子之比（简称P/O比）为3/1。,氧化磷酸化偶联部位,电子传递链自由能变化,三，氧化磷酸化的偶联机理,化学渗透假说,电子经呼吸链传递时，可将质子（H+）从线粒体内膜的基质侧泵到内膜胞浆侧，产生膜内外质子电化学梯度储存能量。当质子顺浓度梯度回流时驱动ADP与Pi生成ATP。,四、氧化磷酸化作用的抑制和解偶联,能够阻断呼吸链中某一部位电子流的物质称为电子传递抑制剂，利用某些特异性的抑制剂切断某部位的电子流，再测定电子传递链中各组分的氧化-还原状态，是研究电子传递顺序的一种重要方法。已知的抑制剂有以下几种：,1,复合物I抑制剂,鱼藤酮（rotenone）、安密妥（amytal）以及杀粉蝶菌素（piericidin），它们的作用是抑制NADH泛醌还原酶，从而阻断电子由NADH向辅酶Q的传递。鱼藤酮是一种极毒的植物物质，常用作杀虫剂使用，安密妥用作麻醉药就是根据这个原理。杀粉蝶菌素的结构类似辅酶Q，因此可以和辅酶Q相竞争。,2,复合物III抑制剂,抗霉素A（antimycin A）是从链霉菌（streptomyces griseus）中分离出的抗菌素，可以抑制电子从细胞色素b到细胞色素c1传递的作用。,氰化物、硫化氢、叠氮化物和一氧化碳等可以抑制细胞色素c氧化酶，从而阻断电子由细胞色素aa3传至氧的作用，这就是氰化物等中毒的原理。,3，复合物IV抑制剂,4，氧化磷酸化作用的解偶联剂,除了上述抑制剂外，还有一类抑制剂可以阻断氧化磷酸化作用，这类物质称为解偶联剂。解偶联剂可使正常紧密联系着的氧化过程与磷酸化过程发生松解，甚至完全拆离，相应地使PO比率下降或变为零。由于氧化速度增加而磷酸化作用下降，结果产生过量的热。在整体的动物过量产热表现为发热及导致由其他代谢紊乱而出现的临床症状，因为ATP相对缺乏，阻滞了某些重要的细胞活动，例如离子的转送，膜的通透性改变等。,常见的解偶联剂有2,4二硝基苯酚(曾用于降体重)、双香豆素、某些水杨酸苯胺的取代物以至游离的水杨酸，即阿斯匹林的代谢物。从用量多少比较，水杨酸苯胺是目前已知的最强效解偶联剂。天然解偶联剂包括胆色素、胆红素、游离脂肪酸，也许还有甲状腺素。这些物质必须在线粒体内达到足够高浓度才起解偶联作用。某些病原微生物产生的可溶性毒素也有解偶联作用，粮食生产以至家庭使用的某些杀虫药，过量时也有解偶联作用。,鱼藤酮,安密妥,抗菌素A,5，解偶联蛋白UCP,化学渗透假说指出，在电子传递链中，从线粒体基质泵出H+，产生H+跨膜电化学势能，这种势能又驱使H+通过ATP合成酶重新回到线粒体基质中，同时合成ATP。然而，线粒体在没有ADP的情况下也可进行呼吸作用，即H+不通过ATP合成酶也可以从线粒体内膜渗漏到线粒体基质中，而不产生ATP。研究发现这种解偶联作用是由线粒体内膜上的UCP所介导的。UCP在产热控制ROS、调控脂肪酸氧化以及肥胖和糖尿病中起重要作用。,UCP解偶联机制,第四节 非线粒体氧化体系,在高等动植物细胞内，还有些其他氧化体系，如微粒体氧化体系、过氧化物酶体氧化体系等。其中以肝脏的微粒体与过氧化物酶体较为重要。它们有不同于线粒体的氧化酶类，组成特殊的氧化体系，在氧化过程中不伴有偶联磷酸化不产生ATP，不是机体氧化产生能的基地而是与某些代谢中间产物或某些药物、毒物的生物转化有关。微粒体(microsome)并非独立的细胞器，是内质网在细胞匀桨过程中形成的颗粒，其中富含催化氧化反应的各种酶类。,一、微粒体氧化体系,微粒体中存在一类加氧酶(Oxygenase)，这类加氧酶也参与代谢物的氧化作用。这类酶催化的氧化反应是将氧直接加到底物分子上。加氧酶类可分为单加氧酶和双加氧酶两种。,1，微粒体中催化氧化反应的酶类,（1）微粒体混合功能氧化酶系,其中包括微粒体细胞色素P450依赖性单加氧酶、微粒体细胞色素b5依赖性单加氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶和NADH-细胞色素P450还原酶；目前发现的细胞色素P450已有20多种，其中CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4是药物代谢过程中比较重要的酶系。,微粒体混合功能氧化酶系催化反应中需要一个氧分子(O2)，其中一个氧原子将参入作为底物的外源有机物质分子中，使其增加一个氧原子，另一个氧原子则被还原为H2O。由于氧分子具有两种作用，故称为混合功能氧化酶，而且因为在反应过程中仅有一个氧原子参入底物，所以亦称为单加氧酶或加单氧酶。反应过程中所需的电子或氢原子则由NADPH或NADH提供。,细胞色素P450与底物结合形成复合物后被还原成2价铁离子。此过程需要黄素蛋白细胞色素P450还原酶和NADPH参与。该还原型复合物P450(Fe3+)-RH能与分子氧反应，生成低自旋的六螯合复合物，底物结合于氧的附近。生成的过氧化物被还原成过氧负离子，此时有细胞色素b5或其他体系参与反应；过氧负离子析出过氧化氢或重排成环氧化物，进而生成氧化型产物和1分子水及恢复到静止状态的细胞色素P450。,（2）微粒体含FAD单加氧酶,其功能及反应机理与细胞色素P-450单加氧酶相似，反应过程中亦需要NADPH和O2，黄素腺嘌呤二核苷酸起传递电子的作用，不需要细胞色素P-450。此酶主要催化仲胺类、叔胺类和一些含硫化合物的氧化反应，例如硫醇类、硫醚类和硫化物等，也参与农药硫代氨基甲酸酯、有机磷化合物的氧化以及烟碱氧化为烟碱-1-N-氧化物的反应。,二、微粒体氧化酶系催化的氧化反应类型,氧化反应是外源有机物质在生物转化过程中获得氧的反应，是生物转化中一个重要过程。化合物结构不同在氧化反应中会发生不同类型的氧化作用。,（1）脂肪烃羟化反应,亦称为脂肪族氧化反应，常见于直链脂肪族化合物烷烃类，其羟化产物为醇类。羟化反应多发生在碳氢链上的碳原子（或-氧化）或-1碳原子。-碳原子是脂肪族碳氢链上倒数第一个碳原子，即最后一个碳原子，-1碳原子与-碳原子相邻，即倒数第二个碳原子。烷烃在体内的-氧化产物为1-醇，-1氧化产物为2-醇，该氧化作用具有立体选择性。,（2）芳香族羟化反应,芳香环上的氢被氧化，形成酚类。例如苯可形成苯酚，苯胺可形成对氨基酚或邻氨基酚。,（3）环氧化反应,在微粒体混合功能氧化酶催化下，碳碳双键可加氧形成环氧化物。有些环氧化物可以致癌，例如氯乙烯的环氧化产物环氧化氯乙烯即为终致癌物。有些环氧化物性质极不稳定，将继续发生水解，形成二醇化物。有许多致癌物本身并不致癌，需要经代谢转化或称代谢活化才形成具有致癌作用的终致癌物，或者经代谢转化先形成近致癌物，并继续代谢转化形成终致癌物。,黄曲霉毒素B1在体内经环氧化反应可形成黄曲霉毒素B1-8,9-环氧化物。此种环氧化物性质并不稳定，可形成11种羟化产物，其中有的为终致癌物，将与DNA等生物大分子结合，诱发突变及癌变。,（4）N-羟化反应,脂肪胺和芳香胺类物质在微粒体混合功能氧化酶催化下，在氨基上引入羟基，所以也称为N-氧化反应。由于底物的不同，可形成不同的代谢产物。苯胺可代表一种类型。苯胺经羟化后形成羟胺，羟胺的毒性较苯胺本身为高，可使血红蛋白氧化成为高铁血红蛋白。具有重要毒理学意义的是有些芳香肤类本身并不致癌，经N-羟化后才具有致癌作用。,2-乙酰氨基芴，经N-羟化形成近致病物N-羟基-2-乙酰氨基芴，并可继续转化为终致癌物。羟化反应如发生在芳香环上，通过芳香族羟化，形成7-羟基-2-乙酰氨基芴，则不具有致癌作用。,（5）脱烷基反应,醚、硫醚以及有机含氮化合物，分子中含有N、S或O原子相连的烷基。在微粒体氧化酶系的作用下，碳原子被氧化并脱去一个烷基，反应产物为分别含有氨基、羟基或巯基的化合物并有醛或酮生成，称为氧化脱烷基反应。根据反应发生的位置不同，可分N-脱烷基反应、O-脱烷基反应和S-脱烷基反应。,致癌物二甲基亚硝胺经脱烷基后，形成单甲基亚硝胺和甲醛。单甲基亚硝胺自身分子重排形成重氮羟化物羟化重氮甲烷。羟化重氮甲烷分解产生自由甲基，可使细胞核内核酸分子的嘌呤碱发生烷基化，诱发突变以及癌变。,（7）脱疏反应,含有C=S双键活P=S双键的药物在体内微粒体氧化酶系的作用下，代谢成为 C=O或P=O，称作脱硫。例如对硫磷经脱硫反应形成对氧磷。硫喷妥(Thiopental)脱硫形成戊巴比妥（Pentabarbital）。,（8）氧化脱氨基反应,氧化脱氨基反应是在微粒体细胞色素P-450依赖性单加氧酶催化下，在邻近氮原子的碳原子上进行氧化，脱去氨基，形成丙酮类化合物，其中间代谢产物为甲醇胺类化合物。,三、还原反应,在厌氧条件下，细胞色素P450还原酶也能催化许多化合物的还原反应，反应需要NADPH提供电子，例如硝基化合物、偶氮化合物等。,(1)羰基还原反应,进行羰基还原反应的化合物主要有醛类和酮类，可分别生成伯醇和仲醇。酮的还原有立体选择性，例如苯乙酮被还原生成S()-甲基苄醇。,(2)含氮基团还原反应,硝基及偶氮基在肝脏可被还原成相应的胺类。催化硝基和偶氮基化合物还原的酶类主要是微粒体NADPH依赖性硝基还原酶。例如硝基苯的还原，在反应过程中首先形成亚硝基苯和苯羟胺，最终产物为苯胺。硝基苯可以引起高铁血红蛋白症，主要是因为还原产物苯基羟胺所导致。,脂溶性偶氮化合物百浪多息经偶氮还原反应先形成含联亚氨基(-NHNH-)的中间产物，然后形成具有生理活性的氨苯磺胺。,