农产品中其它成分分析.ppt

第7章 农产品中其它成分分析,本章重点和难点：酸度、维生素和其他成分的测定7.1 有机酸的分析（掌握）7.2 酸度的测定7.3 维生素的测定（掌握）7.4 其它成分分析（掌握）7.3.1 单宁 7.3.2 硫甙 7.3.3 其它7.5 黄曲霉素测定7.6 防腐剂的测定,概述,农产品中其它成分分析包括：有机酸维生素单宁咖啡碱儿茶酸叶绿素柠檬苦素吲哚,7.1 有机酸的分析（掌握）,有机酸包括植物：苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、草酸等。肉类和鱼类：乳酸,Lactic acid,食品中常见的有机酸 食品中常见的有机酸有柠檬酸，苹果酸，酒石酸，草酸，琥珀酸，乳酸，及醋酸等有机酸在食品中的分布极不均衡，果蔬中所含有机酸种类较多，但不同果蔬中所含的有机酸种类也不同;酿造食品（如酱油，果酒，食醋）中也含有多种有机酸。,1.食品中有机酸的种类与分布,食品中常见有机酸分布 果蔬中有机酸含量取决于其品种，成熟度以及产地气候条件等因素；其它食品中有机酸的含量取决于其原料种类，产品配方以及工艺过程等。,品种成熟度气候,植物性食品,加工食品,原料种类产品配方工艺过程,2.有机酸组分的色谱测定,气相色谱法原理：在硫酸催化下，使有机酸成为丁酯衍生物，用气相色谱法分别定量。,气相色谱法具有选择性好、柱效高、灵敏度高等特点。气相色谱法可以分析各种气体，以及在适当温度下能气化的液体或定量裂解的固体，应用范围很广。,气相色谱法进行定性分析时，一般要将试样的色谱图与纯物质的色谱图进行对照以确定试样的组成。如果缺乏纯物质，定性就比较困难。但是，将气相色普法与质谱、红外光谱、核磁共振谱、激光拉曼光谱等技术联用则能克服这一缺点。,气相色谱法虽然优点很多，但是这种方法主要是用于测定较易挥发的物质。70%以上的化合物是低挥发性、相对分子量大或热不稳定性的，不进行衍生化就不能直接用气相色谱测定。高效液相色谱法恰好弥补了这方面的不足，所以后者在分析化学中得到广泛的应用。,高效液相色谱法中可供选择的流动相种类较多，从有机溶剂到水溶液，既能用纯溶剂，也可用二元或多元混合溶剂，并可任意调配比例，通过改变溶剂极性或强度进而改变色谱柱效能、分离选择性和组分的容量因子，最后实现改变色谱系统分离度的目的。,此外，高效液相色谱法易于收集流出组分，可为红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯试样，并可利用制备柱进行较大量的制备。由于高效液相色谱仪器设备昂贵，柱填料和流动相价格高，因此它的普及受到一定限制。,戊酸,己酸,庚酸,5-20烷酸,7.2.酸度的测定,1 概述（1）酸度的概念：总酸度 有效酸度 挥发酸（2）测定酸度的意义2 酸度的测定2.1 总酸度的测定2.2 挥发酸的测定2.3 有效酸度（pH值）的测定,1概述,（1）酸度的概念,总酸度是指食品中所有酸性成分的总量。它包括未离解的酸的浓度和已离解的酸的浓度其大小可借碱滴定来测定故总酸度又可称为“可滴定酸度”。,总酸度,有效酸度,有效酸度是指被测液中H+的浓度，准确地说应是溶液中H+的活度，所反映的是已离解的那部分酸的浓度，常用pH值表示。其大小可借酸度计（即pH计）来测定。,挥发酸是指食品中易挥的有机酸，如甲酸，醋酸及丁酸等低碳链的直链脂肪酸。其大小可通过蒸馏法分离，再借标准碱滴定来测定。,挥发酸,（2）测定酸度的意义,食品中的酸不仅作为酸味成分，而且在食品的加工贮运及品质管理等方面被认为是重要的成分，测定食品中的酸度具有十分重要的意义。,（2）测定酸度的意义,有机酸影响食品的色、香、味及稳定性;食品中有机酸的种类和含量是判断其质量好坏的一个重要指标;利用有机酸的含量与糖的含量之比，可判断某些果蔬的成熟度。,有机酸在果蔬中的含量，因其成熟度及其生长条件不同而异一般随成熟度的提高，有机酸含量降低，而糖含量增加，糖酸比增大，故测定酸度可判断某些果蔬的成熟度，对于确定果蔬收获期及加工工艺条件很有意义。,2 酸度的测定 2.1总酸度的测定(1)原理,样品中的有机酸用标准碱滴定被中和成盐类。RCOOH+OH-=RCOO-+H2O用酚酞做指示剂，在pH 8.2达终点。,(2)适用范围,本法适用于各类色浅的食品中总酸含量的测定。,(3)试剂,0.1mol/LNaOH标准溶液：称取氢氧化钠（AR）120g于250mL烧杯中，加入蒸馏水100mL，摇振使其溶解，冷却后置于聚乙烯塑料瓶中，密封,放置数日澄清后,取上清液5.6ml，加新煮沸过的并已冷却的蒸馏水1000ml，摇匀。1%酚酞乙醇溶液：称取酚酞1g溶解与100 ml 95%乙醇中。问题：一定要用贮于聚乙烯塑料瓶吗？用玻璃瓶装，应用什么塞？,NaOH标定 精密称取0.6g(准确至0.0001g）在1051100C干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾，加50ml新煮沸的冷蒸馏水，摇振使其溶解，加二滴酚酞指示剂，用配制的NaOH标准溶液滴定到溶液呈微红色30秒不褪。同时做空白实验。问题：滴定后放置一段时间溶液褪色，是否需要再滴定？,计算：式中：c-氢氧化纳标准溶液的摩尔浓度，mol/L；m-基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；V1-标定时所耗用氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2-空白实验中所耗用氢氧化钠标准溶液的体积，mL；204.2-邻苯二甲酸氢钾的摩尔质量，g/mol；,（4）操作方法样液制备 固体样品、干鲜果蔬、蜜饯及罐头样品：将样品用粉碎机或高速组织捣碎机捣碎并混合均匀。取适量样品（按其总酸含量而定），用15ml无CO2蒸馏水（果蔬干品须加89倍无CO2蒸馏水）将其移入250ml容量瓶中在75800C的水浴上加热0.5小时（果脯类沸水浴加热1小时），冷却后定容，用干燥滤纸过滤，弃去初始滤液25mL收集滤液备用。问题：1、为什么要用无CO2蒸馏水？如何制备？2、弃去初始滤液后，会影响测定的结果吗？,含CO2的饮料、酒类：将样品置于400C水浴加热30分钟，以除去CO2,冷却后备用。调味品及不含CO2的 饮料、酒类：将样品混匀后直接取样，必要时加适量水稀释（若样品浑浊，则需过滤）。,咖啡样品：将样品粉碎通过40目筛，取10g粉碎的样品于锥形瓶中，加入75ml 80%乙醇，加塞放置16小时，并不时摇动，过滤。固体饮料：称取510g样品，置于研钵中，加少量无CO2蒸馏水，研磨成糊状，用无CO2蒸馏水移入250ml容量瓶中，充分振摇，过滤。,测定 准确吸取上法制备滤液50ml，加酚酞指示剂34滴，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定致微红色30秒不褪，记录消耗0.1mol/LNaOH标准溶液mL数。,（5）结果计算 总酸度（%）式中：c-标准NaOH溶液的浓度，mol/L V-滴定消耗标准NaOH溶液的体积，mL m-样品质量或体积，g或ml V0-样品稀释液总体积，mL;V1-滴定时吸取的样液体积，mL;K-换算为主要酸的系数，即1毫摩尔氢氧化钠相当于主要酸的克数。,因食品中含有多种有机酸，总酸度测定结果通常以样品中含量最多的那种酸表示。一般分析葡萄及其制品时，用 酒石酸表示，其K=0.075；分析柑桔类果实及其制品时，用柠檬酸表示，K=0.06或0.070（带一分子水）；分析苹果、核桃类果实及其制品时，用苹果酸表示，K=0.067；分析乳品、肉类、水产品及其制品时，用乳酸表示，K=0.090；分析酒类、调味品时，用乙酸表示，K=0.060。,（6）说明 样品浸渍、稀释用蒸馏水不能含有CO2,因为CO2溶于水会生成酸性的H2CO3形式，影响滴定终点时酚酞颜色变化。无CO2的蒸馏水的制备方法为：将蒸馏水煮沸20分钟后，用碱石灰保护冷却；或将蒸馏水在使用前煮沸15分钟并迅速冷却备用。必要时须经碱液抽真空处理。样品中CO2对测定也有干扰，故对含有CO2饮料、酒类等样品在测定之前须除去CO2.,（6）说明,样品浸渍、稀释之用水量应根据样品中总酸含量来慎重选择，为使误差不超过允许范围，一般要求滴定时消耗0.1 mol/LNaOH溶液不得少于5ml，最好在1015ml.,由于食品中有机酸均为弱酸，在用强碱(NaOH)滴定时,其滴定终点偏碱，一般在pH8.2左右，故可选用酚酞做终点指示剂。,（6）说明,（6）说明,若样液有颜色（如带色果汁等），则在滴定前用与样液同体积的不含CO2蒸馏水稀释之或采用试验滴定法，即对有色样液，用适量无CO2蒸馏水稀释，并按100ml样液加入0.3mL酚酞比例加入酚酞指示剂，用标准NaOH滴定近终点时，取此溶液23ml移入盛有20mL无CO2蒸馏水中（此时，样液颜色相当浅，易观察酚酞的颜色），若实验表明还没有达到终点时，将特别稀释的样液倒回原样液中，继续滴定直至终点出现为止。用这种在小烧杯中特别稀释的办法，能观察几滴0.1mol/LNaOH滴液所产生的酚酞颜色差别。若样液颜色过深或浑浊，则宜用电位滴定法。,（6）说明,各类食品的酸度都以主要酸表示，但是有些食品（如乳品，面包等)亦可用中和100g(mL)样品所需0.1mol/L（乳品）或1mol/L（面包）NaOH溶液mL数表示，符号为0T。鲜牛乳的酸度为16180T，面包酸度一般为390T.,2.2挥发酸的测定 挥发酸是食品中含低碳链的直链脂肪酸，主要是醋酸和痕量的甲酸、丁酸等，不包括可用水蒸汽蒸馏的乳酸、琥珀酸、山梨酸及CO2和SO2等。正常生产的食品中，其挥发酸的含量较稳定，若在生产中使用了不合格的原料，或违背正常的工艺操作，则会由于糖的发酵而使挥发酸的含量增加，降低了食品的品质，因此，挥发酸的含量是某些食品的一项质量控制指标。,总挥发酸可用直接法或间接法测定。直接法是通过水蒸气蒸馏或溶剂萃取把挥发酸分离出来，然后用标准碱滴定。间接法是将挥发酸蒸发排除后，用标准碱滴定不挥发酸，最后从总酸度中减去不挥发酸即为挥发酸含量。前者操作方便，较常用，适用于挥发酸含量较高的样品。若蒸馏液有所损失或被间接法污染，或样品挥发酸含量较少，宜用后者。,水蒸气蒸馏法,原理,样品经适当处理后，加适量磷酸使结合态挥发酸游离出来，用水蒸气蒸馏分离出总挥发酸，经冷凝，收集后，按酸的测定操作。,问题：1、加磷酸的目的是什么？2、整个装置的操作要点的什么？,(2)适用范围 本方法适用于各类饮料、果蔬及其制品（如发酵制品、酒等)）中总挥发酸含量的测定。,水蒸汽蒸馏装置 蒸汽发生瓶 样品瓶 接受瓶,0.1mol/L NaOH标准溶液：同总酸度的测定。1%酚酞乙醇溶液：同总酸度的测定。10%磷酸溶液：称取10.0g磷酸，用少许无CO2蒸馏水溶解并稀释至100ml.,(3)试剂,(4)仪器,水蒸汽蒸馏装置电磁搅拌器,(5)样品处理方法,一般果蔬及饮料可直接取样 含CO2的饮料、发酵酒类，须排除CO2，方法是取80100ml(g)样品于锥形瓶中，在用电磁搅拌器的同时，于低真空下抽气24分钟以除去CO2 固体样品（如干鲜果蔬及其制品）及冷冻、粘稠等制品，先取可食部分加入定量水（冷冻制品须先解冻），用高速组织捣碎机捣成浆状，再称取处理样品10克，加无CO2蒸馏水溶解并稀释至25ml。,肉类制品：称取10克已除去油脂并捣碎的样品于250ml锥形瓶中，加入100ml无CO2蒸馏水，浸泡15分钟并随时摇动，过滤后取滤液测定。鱼类等水产品：称取10g切碎样品，加无CO2蒸馏水100mL浸泡30分钟（随时摇动），过滤后取滤液测定。,皮蛋等蛋制品：取皮蛋数个，洗净剥壳，按皮蛋：水为2：1的比例加入无CO2蒸馏水，于组织捣碎机捣成匀浆。再称取15g匀浆（相当于10g样品），加无CO2蒸馏水至150ml，搅匀，纱布过滤后称取滤液测定。,罐头制品（液固混合样品）：先将样品沥汁液，取浆汁液测定；或将液固混合捣碎成浆状后，取浆状物测定。若有油脂，则应先分离出油脂。含油或油浸样品：先分离出油脂，再把固形物经组织捣碎机捣成浆状，必要时加少量无CO2蒸馏水（20mL/100g样品）搅匀后进行pH值测定。,(6)测定,样品蒸馏：取25mL经上述处理的样品移入蒸馏瓶中，加入25mL无CO2蒸馏水和1mL10%H3PO4溶液，加热蒸馏至馏出液约300 mL为止。于相同条件下作一空白实验。滴定：将馏出液加热至60650C（不可超过），加入3滴酚酞指示剂，用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定到溶液为微红色30秒不褪色即为终点。,(7)结果计算,食品中总挥发酸通常以醋酸的重量百分数表示，计算公式如下：挥发酸 以醋酸计，g/100g(mL)样品=公式中：m-样品质量或体积，g或mL;V1-样液滴定消耗标准NaOH的体积,mL;V2-空白滴定消耗标准NaOH的体积,mL;c-标准-NaOH溶液的浓度,mol/L;0.06-换算为醋酸的系数，即1毫摩尔 氢氧化钠相当于醋酸的克数,3 有效酸度（pH）测定,果蔬食品的pH变动取决于原料品种和成熟度，以及加工方法。pH与总酸度没有严格的关系测定：pH仪、试纸法、标准色管。以pH仪为推荐方法,电位法（1）原理 以玻璃电极为指示电极，饱和甘汞电极为 参比电极，插入待测样液中组成原电池，该电池电动势大小与溶液pH值有直线关系：E=E0-0.0591pH(250C)即在250C时，每相差一个pH值单位就产生59.1mV的电池电动势，利用酸度计测量电池电动势动势并直接以pH表示，故可从酸度计上读出出样品溶液的pH值。,操作方法,样 品 处 理,酸度计的校正,样液pH值的测定,酸 度 计 的 使 用 操 作 规 程活化电极 取出酸度计，检查仪器短路插插入指示电极插座，调节开关,拔掉短路插 安装仪器和电极 用标准溶液标定所需的范围,清洗电极 擦干电极 把电极插入被测溶液中,测定 清洗并擦干电极,7.3 维生素的测定（掌握）,据估计，维生素有30余种，其中有20种被确知为与人和动物健康有关。常需测定的维生素有：维生素A,维生素B1,B2;维生素C维生素D,维生素E,胡萝卜素,维生素C的测定方法,2.4-二硝基苯肼法测定维生素全量2.6-二氯靛酚滴定法测定还原性维生素荧光法测定活性维生素比浊法,7.2.1 维生素C总量的测定（2.4-二硝基苯肼法）,The U.S.AI for vitamin C is 90 milligrams per day for men and 75 milligrams per day for women.AI：Adequate Intake,还原性 脱氢型 2,3-二酮古乐糖酸,维生素C不能在人体内合成，必须依靠膳食供给。当人体中缺少维生素C时，就会出现牙龈出血、牙齿松动、骨骼脆弱、粘膜及皮下易出血、伤口不易愈合等症状。维生素C能阻止亚硝酸盐和仲胺在胃内结合成致癌物质，从而减低癌的发病率。,植金虎尾,2.4-二硝基苯肼法测定原理,总抗坏血酸包括还原型、脱氢型抗坏血酸和二酮古乐糖酸。2.4-二硝基苯肼法用于测定其总量。,2.4-二硝基苯肼法测定原理,其原理：首先将样品中还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，进一步水解生成二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2.4-二硝基苯肼法偶连生成红色的脎。其颜色强度与二酮古乐糖酸成正比。,7.2.2 还原性维生素C的测定（2.6-二氯靛酚滴定法）,一、实验目的食品中的维生素C含量是食品品质的重要指标，通过本实验掌握2,6二氯靛酚滴定法测定维生素C。,二、实验原理,维生素C结构中有烯二醇结构的存在，因此具有还原性，能将蓝色染料2,6二氯靛酚还原为无色的化合物，维生素C则被氧化为脱氢维生素C。,二、实验原理,2,6二氯靛酚具备酸碱指示及氧化还原指示两种特性；在碱性介质中呈蓝色，酸性介质中呈浅红色。氧化态时为深蓝色（碱性介质）或浅红色（酸性介质），还原态变为无色。根据这种特性，用蓝色的碱性染料标准溶液,对含维生素 C的酸性浸出液进行氧化还原滴定,染料被还原为无色,当到达滴定终点时,多余的染料在酸性介质中则表现为浅红色,由染料用量计算样品中还原型抗坏血酸的含量。,实验注意事项,1、样品取样后，立即浸泡在2%的草酸溶液中，以免维生素C发生变化。2、对动物性样品可用10%三氯乙酸代替2%草酸提取。对含有大量铁如久贮的罐头食品可用8%醋酸提取。,实验注意事项,3、若滤液有颜色可用白陶土去色。加白陶土脱色过滤后要迅速滴定。4、滴定是要不断摇动三角瓶。整个滴定过程必须迅速。5、测定样品时要同时做空白。,7.2.3 维生素C的测定（荧光法）,原理样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺(OPDA)反应生成有荧光的喹喔啉(quinoxaline)，其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。,脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与邻苯二胺（OPDA）反应，以此排除样品中荧光杂质产生的干扰，最小检出限0.022g/mL。,7.2.4 维生素C的测定（比浊法）,原理：在酸性介质中，抗坏血酸与亚硒酸定量的进行氧化还原反应，1mol的抗坏血酸能将2mol的亚硒酸还原生成元素硒。在抗坏血酸浓度在0-4mg/25-50ml范围内，溶液的浊度与抗坏血酸浓度成正比。,7.4 其它成分分析（掌握）,农产品中含有许多与品质有关的成分，如单宁、棉酚、硫甙、咖啡碱等。有些成分还与产品的功效有关，是至关重要的“功效成分”。如人参根中主要功效：人参皂甙,7.4.1 单宁,单宁(Tannin)亦称鞣质，广泛存在植物界，它是一种结构复杂的高分子多元酚类化合物。某些粮食或饲料中的单宁含量直接决定着它们的品质，因此在品质分析中需要检测单宁的含量。,Characteristics of tannins,Oligomeric(寡聚)compounds with multiple structure units with free phenolic groups,molecular weight ranging from 500 to 20,000,soluble in water,with exception of some high molecular weight structures,ability to bind proteins and form insoluble or soluble tannin-protein complexes.,Tannins are usually subdivided into two groups:,Hydrolyzable tannins(HT)Proanthocyanidins(PA)(often called Condensed Tannins),Hydrolyzable tannins:Mainly of gallic acid五倍子酸,没食子酸or ellagic acid with sugar molecule.The major source of these tannins in wine comes from oak橡木extraction.,C-C bond or C-0 bond of flavonoids(e.g.catechin儿茶酚,epicatechin表儿茶酸and leucocyanidin 无色花青素)to form polymers which contain 2-10 monomeric units.,Condensed tannins,单宁的测定方法,有：高锰酸钾法，动物胶沉定法络合滴定法比色法,磷钼酸-钨酸钠比色法,实验原理单宁类化合物在碱性溶液中还原磷钼酸钨酸钠，生成深蓝色的物质，在760nm出有最大的吸收峰。蓝色的深浅与单宁的含量成正相关，可用分光光度法测定。,主要仪器及试剂,1、分光光度计2、多孔恒温水浴锅3、FD试剂：在盛有750mL落水的1000mL烧瓶中加入钨酸钠(Na2WO4.2H2O，三级)100g磷钼酸(H7 P(Mo2O7)6.X H2O,三级)20g及H3PO4（三级）50mL接冷凝管回流2h，冷却后稀释至1000mL。,4、单宁酸标准溶液：用水溶解纯单宁酸50mg，转入500mL容量瓶中，定容。此溶液单宁的浓度100ug/mL。,7.4.2 硫甙,我国油菜种植面积居世界首位。我国油菜饼粕中含有高量的硫葡萄糖甙（高达12-18%），大大超过国际规定的0.3%标准。,英文名 Erucic acid 别名 cis-13-Docosenoic acid 芥酸;二十二-13-烯酸;二十二碳-13-烯酸,硫酸钡重量法,硫甙加酸水解产生HSO4-,加钡盐形成硫酸钡沉淀。本法用共沉淀法分离硫甙中的硫酸根，方法简单，易于掌握，结果稳定可靠。,原子吸收光谱法,油菜籽中含有多种硫葡萄糖甙（简称硫甙），这些甙类化合物本身没有毒性，而降解物有毒。降解物的存在直接影响了油菜饼作饲料的利用价值。,实验原理,硫甙是亲水化合物，加酸水解析出酸式硫酸盐，加入一定量的BaCl2来沉淀HSO4-，多余的钡用原子吸收法测定，通过与钡沉淀的硫酸根间接求得硫甙含量。,实验原理,为了使有机硫全部氧化，由过氧化氢-高锰酸钾体系提供氧化源。5H2O2+2KMnO4+6HClMnCl2+2KCl+8H2O+5O2,主要仪器,原子吸收分光光度计AAS,油菜籽(饼)中硫葡萄糖甙总量的快速测定,方法原理硫葡萄糖甙在酸性条件下与氯化钯生成有色复合体沉淀。当加入一定量的分散剂羧甲基纤维素钠溶液时,沉淀亦消失,溶液变为清亮,适宜比色测定。最大吸收波长540nm,7.4.3 其它,叶绿素的测定：,叶绿素的化学结构,叶绿素的提取分离及定量测定,绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于含有水的有机溶剂，故常用95的酒精或用酒精、丙酮和水的混合液提取或80丙酮提取。,器材与试剂,器材：721型分光光度计、电子天平、量筒、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、移液管（1mL）、试管及试管架、洗耳球、酒精灯等。试剂：丙酮、80%丙酮、醋酸酮、5%盐酸、碳酸钙、石英砂等。,方法与步骤,称取1g左右的鲜叶，剪碎，放入研钵中。加少许碳酸钙和少量的石英砂(中和细胞中的酸，防止镁从叶绿素分子中移出)与3ml 80%丙酮。在研钵中快速研磨。用80%丙酮无损转入刻度试管中，定容至15ml。过滤。滤液即为色素提取液。,结果与计算,样品中叶绿素含量(mgChl/g鲜重)=比色杯中叶绿素含量稀释倍数/样品量(g鲜重)Ca Cb C总,原理：,根据叶绿素在可见光区的吸收光谱的不同，利用分光光度法测定特定波长下的吸光度，利用公式计算叶绿素含量。,Ca=12.7A663-2.69A645Cb=22.9A645-4.68A663,注意事项！,酒精灯用完后要及时用灯帽盖灭，以防着火！用分光光度法测定物质含量时，分光光度计的波长调节要准确，参比杯与测定杯的透光率要一致。,7.5 黄曲霉毒素的测定,黄曲霉毒素（Aflatoxins,简写AFT），是黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉等产毒株的代谢产物，是一群结构类似的化合物。目前已发现17种黄曲霉毒素，根据其在波长为365nm紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为B、G二大类，其中B大类在氧化铝薄层板上于紫外光下呈现蓝色荧光，而G大类则呈绿色荧光。,黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，也是目前最强的化学致癌物质。其中AFT B1的毒性和致癌性最强，帮其在食品中允许量各国都有严格规定。AFT主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染严重。,黄曲霉毒素允许量标准,食品品种允许量标准（ppb或10-6）玉米、花生、花生油20玉米及花生制品20大米、其他食用油10裱花蛋糕、饼干、面包5婴儿代乳食品不得检出,重点,薄层层析法测黄曲霉毒素 薄层层析是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1990年，它被列为AOAC(association of official agricultural chemists)标准方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。,。,原理,本法是利用样品中的黄曲霉毒素B1，经有机溶剂提取、净化、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉毒素B1的含量。薄层色谱法黄曲霉毒素Bt的最低检出量为0000 4ug，最低检出浓度为5ugKg。,仪器,小型粉碎机样筛电动振荡器玻璃浓缩器玻璃板5cm20cm、薄层板涂布器展开槽(25cm6cm4cm)紫外光灯100一125w、波长365nm滤光片、微量注射器,试剂,三氯甲烷、正己烷(沸程3060)或石油醚(沸程6090)、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。以上试剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸。,吸附剂硅胶,薄层层析用硅胶有多种规格。应用最多的是掺有粘合剂石膏的硅胶，称有硅胶G，其掺入的石膏量为5-20%不等。硅胶有时含有铁盐及氯离子等杂质，它们可被展开剂提取出来，对层析的结果产生一定影响。硅胶H不含粘合剂和其他添加剂（不会被展开剂提出杂质）。硅胶HF254 掺有荧光指示剂，可在短波254纳米的紫外光下观察到荧光。硅胶GF254含石膏及荧光物质。,黄曲霉毒素B1标准溶液,1、黄曲霉毒素B1标准贮备液：准确称取112mg AFTB1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光、于冰箱4保存。此标准液浓度约为10ugmL。先用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯一乙腈混合液调整其浓度为准确100ugmL。在350nm，AFTB在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩尔消光系数为19 800.,2、黄曲霉毒素B标准使用液：I液(1.0ugmL)：取1mL AFTB标准液(10.0ugmL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。液(0.2ugmL)：取I液1mL，按上法定容5mL。液(0.04ugmL)：取液1mI。，按上法定容5mI。思考：在配制黄曲霉毒素B标准使用液时，为什么需要用贮备液来稀释而不是直接配制？,次氯酸钠溶液,配制：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3H2O)溶于500mL温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸25gL。思考题：1、次氯酸钠溶液的作用是什么？消毒用，污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果。2、为什么次氯酸钠溶液能起到消毒的作用？,操作步骤,样品处理提取 浓缩薄板制备点样展开定量,(1)样品处理,样品从大样经粗碎及连续多次用四分法缩减至05l kg后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛，花生样品全部通过10目筛、混匀。,(2)提取,称取20.00g经粉碎样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水清液。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00mL甲醇水溶液置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分层，如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。,浓缩,将蒸发皿放在通风柜，于65水浴上通风挥干，然后于冰盒上冷却23min后，准确加入1mL苯一乙腈混合液。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，再用此滴管吸取上清液转移于2mL的具塞试管中。注意：若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失。,测定单向展开法,1、薄板制备：称取3g硅胶G，加23倍量的水，研磨12min呈糊状后，倒人涂布器推成5cm20cm，厚度约0.25mm的薄层板3块。在空气中干燥15min，在100活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存23d，若放置时间较长，可再活化后使用。,点样,将薄板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血红素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距为lcm，点直径约3mm，在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吸边加。滴加样式如下：,第一点：10L AFTB，标准使用液(004gmL)。第二点：20L样液。第三点：20L样液+10L 0.04gmL AFTBl标准使用液。第四点：20L样液+10L 0.02tLg，m L AFTB。标准使用液。,展开与观察,在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展开1012cm，取出，在紫外光下观察结果，方法如下：a由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标准点与样液中AFTB1荧光点重叠。若样液为阴性，薄板上第三点AFTB1为0000 4g，可用作检查样液中AFTB1最低检出量是否正常出现；若样液为阳性；则起定性作用。薄层板上第四点AFTB1标准为0002ug主要起定位作用。b若第二点与AFTB1标准点的相应位置上无蓝色荧光点，则表示样品中AFTBl含量5ugkg；若在相应位置上有蓝色荧光点，则须进行确证试验。,确证试验,为确认薄层样上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙酸，产生AFTB1的衍生物，展开后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄层板左边依次滴加两个点。第一点：10uL 004ugmL AFTBl标准使用液。第二点：20L样液于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min(板上温度不高于40)，再于薄层板上滴加以下两点。第三点：10uL 0.04ugmL AFTBl标准使用液。第四点：20L样液。,按上法展开并观察，样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为标准与标准的衍生物空白对照。稀释定量：样液中的AFTB1荧光点的荧光强度，如与AFTB1。标准点最低检出量(0.00 04g)的荧光强度一致，则样品中AFTB1含量为即为5gkg 若样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计，减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下：第一点：l0uL AFTB1，标准使用液(0.04ugmL)。第二点：根据情况滴加10uL样液。第三点：根据情况滴加15uL样液。第四点：根据情况滴加20uL样液。,4)结果计算 X=式中：X 一 样品中AFTBl的含量，ugkg；V1一加入苯一乙腈混合液的体积，mL；V2出现最低荧光时滴加样液的体积，mL；D一样液的总稀释倍数；m1加入苯一乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g；0.0004AFTBl的最低检出限量，ug。,测定双向展开法,原理 如用单向展开法后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了AFTB1的荧光强度，需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚做横向展开，将干扰的杂质展至样液点的一边，而AFTB1不动，然后再用丙酮一三氯甲烷(8+92)做纵向展开，样品在相应处的杂质底色大量减少，因而提高了方法的灵敏度。,操作步骤,(1)点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上，在距左边缘081cm第二篇食品理化检测技术处，各滴加10uL AFTB1(0.04ugmL)标准液，在距左边缘2.83cm处，各滴加20uL样液。然后在第二块板的样液点上滴加l0uL AFTBl(0.04ugmL)标准液，在第三块板的样液点上滴加10uL AFTB1(0.02ugmL)标准液。,(2)展开：a横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边，置于展开槽内展开，展至板端后，取出挥干。根据情况，需要时，可再重复l2次。b纵向展开：挥干的薄层板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展开至1012cm为止。丙酮与氯甲烷的比例，根据不同条件自行调节。,观察与评定结果,a在紫外光下观察第一、二块板，若第二块板在AFTB1标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板与第二板的相同位置上未出现荧光，则样品中AFTBl含量5ugkg.b若第一块板与第二块板的相同位置上出现荧光点，则将第一块板与第三块板比较，这第三块板上第二点与第一块板上第二点的相同位置上的荧光点是否与AFTB1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，三块板可以同时做，也可按顺序做。当第一块板出现阴性时，第三块板可以省略，如第一块板为阳性，则第二块板可省略，直接做第三块。,确认试验,另取薄层板二块，于第四、五两板距左边缘0.81cm处，各滴加10u LATTB1(0.04ugmL)标准液及一小滴三氟乙酸；在距左边缘2.83cm处，于第四板滴加20uL样液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加20gL样液、10uL。AFTBl(0.04ugmL)标准液及一小滴三氟乙酸，反应5min后，用热风吹2min(板上温度不高于40)。再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与AFTB1标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。若样液AFTB1含量较高时，则将样液稀释后，按单向展开法中(4)做确认试验.,(5)稀释定量：若样液中AFTBl含量较高，可按单向展开法中(5)稀释定量操作。若AFTB1含量较低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰，影响结果判断，可将样液再做双向展开法测定，以确定含量。3.2.3 结果计算 同单向展开法。3.2.4 说明及注意事项 用过后受污染的玻璃器皿，应经次氯酸溶液(25gL)，浸泡消毒后再清洗之。,7.6 防腐剂的测定,概论薄层层析法苯甲酸、山梨酸测定,防腐剂是指能防止食品腐败、变质，抑制食品中微生物繁殖，延长食品保存期的物质，它是人类使用最悠久、最广泛的食品添加剂。,防腐剂的种类,我国允许使用的品种主要有：苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、对羟基苯甲酸乙酯和丙酯、丙酸钠、丙酸钙、脱氢乙酸等。非允许的防腐剂：硼砂、水杨酸、氯霉素、青霉素,防腐剂的测定方法,GB/T5009292003 第一法 气相色谱法 第二法 高效液相色谱法 第三法 薄层色谱法本标准规定了酱油、水果汁、果酱等食品中苯甲酸、山梨酸含量的测定方法。本标准适用于酱油、水果汁、果酱等食品中苯甲酸、山梨酸含量的测定。,教学重点、难点,薄层层析法薄层色谱法测定苯甲酸和山梨酸,原理,利用样品中各组分对吸附剂吸附能力的不同，发生了无数次吸附和解吸过程。对吸附剂吸附能力弱、对展开剂溶解度大的组分随流动相迅速向前移动，可较快地随着展开剂迁移到层析板的上端；对吸附剂吸附能力强的组分移动慢，则留在层析板的下端。利用各组分在展开剂中溶解能力和被解吸能力的不同，最终将各组分彼此分开。,实验流程,制板活化点样展开定性或定量,1、制板吸附剂均匀地涂在玻璃板上作为固定相，经干燥、活化后，称薄层板。将吸附剂均匀地涂在玻璃板上这个过程称制板。2、点样把含有不同组成的被测样品，点在涂有吸附剂的薄层板上，称点样。3、展开由于物质中各组分受到吸附剂的吸附力和溶剂的解吸附力的反复作用，各组分在层析板上向前迁移过程称为展开，选用适当的有机溶剂，通过毛细管作用，逐步浸润层析板，有机溶剂称为展开剂（流动相）。,定性或定量,展开后使各组分分离，再根据比移值和斑点的大小进行定性或定量。,吸附剂,分离效果及层析速度主要取决一吸附剂的粒度的大小。而吸附作用则与颗粒本身的微孔大小有关。吸附剂的活性：对于同一吸附剂，若以不同的方法制备处理，其吸附能力也有强弱的变化，一般常以“活性”表示吸附力的强弱。分为五级：一级活性最强，五级活性最弱。一般用二三级。吸附剂的常用种类有：硅胶、聚酰胺,薄层板制备,1、平铺法：用购置或自制的薄层涂布器，进行制板，涂层既方便又均匀，是科研中常用的方法。2、倾注法：将调好的浆料倒在玻璃板上，用手摇晃，使其表面均匀平整，然后放在水平的平板上晾干。这种制板方法厚度不易控制。,注意事项,用湿法制薄层，应入在水平的台面上，否则由于台面不平而使吸附剂糊状体向低处流动，造成薄层厚度不一致。晾干时应放在通风良好的地方，无灰尘，以防薄层被污染。烘干后应放在干燥器中冷却、贮存。,活化,活化的目的：是为了增加吸食剂的吸附能力，即增加活性。操作：湿法制板都应进行晾干、烘干干燥。薄层板经过自然干燥后，失去了大部分水分才能进行活化处理。活化的温度为105-