免疫扩散实验(双向双扩散)-生物技术第四组.ppt

免疫扩散实验（双向双扩散）,2010级生物技术第四组,实验目的,了解双向琼脂扩散的原理和用途。掌握抗体效价的测定方法。观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。,实验原理,双向双扩散简称双扩散，此法是一种定性试验。可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝胶中各自向四周扩散，如果抗原和抗体相对应，则在二者比例适当处形成白色沉淀线；若抗原和抗体无关就不会出现沉淀线。此试验可以检测抗原或抗体的纯度，滴定抗体的效价，以及用已知抗原（抗体）检测和分析未知抗体（抗原）。,实验材料,生理盐水、1%琼脂（用于制作琼脂扩散试验平板）已知传染性法氏囊病毒抗原、待检血清打孔器、微量加样器、枪头、酒精灯、搪瓷盒等,实验步骤,制板：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水，煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至60左右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。注意勿产生气泡。打孔：待琼脂凝固好后用打孔器打孔，孔径和孔距依不同疫病检疫规程而定，一般孔径35mm，孔间距47mm。孔型多为7孔，中央1孔，周围6孔（如梅花孔）。用针头挑出孔内琼脂。封底：将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感受微烫即可。,抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加入已知抗原，于周围孔加倍比稀释的血清，每个稀释度加1孔。加样时不要使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。扩散：加样完毕后，将琼脂板放于湿盒内，保持一定的湿度，置于37温箱中扩散2448小时观察结果。,图1,结果判定,用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。,用梅花孔检测抗血清的效价，操作时将抗原置于中心孔，抗血清倍比稀释后置于周围孔，以出现沉淀带的血清最高稀释倍数为该血清的琼扩效价。若凝胶中抗原、抗体是特异性的，则形成抗原抗体复合物，在两孔之间出现清晰致密的白色沉淀线，为阳性反应。若在72小时内仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与备检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。,结果判定,双向免疫扩散凝胶染色图,注意事项,浇制琼脂板时要均匀、无气泡。孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂。加样时应尽量避免气泡或加到孔外，以保证结果的准确性。注意微量进样器每加一个样品之后，更换枪头。,思考题,如何进行血清琼扩效价的测定？,