克隆载体的特征及类型.ppt

第三章 基因克隆的载体,质粒（plasmid）,噬菌体或病毒DNA,粘粒（cosmid）与噬菌粒,人工染色体载体,载体的功能及特征,载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。,第一节 载体的功能及特征,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体应具备的条件,有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；具有筛选转化子的选择性标记基因；分子量小，拷贝数多；具有较高的外源DNA的载装能力；安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。,自主复制型载体和附加载体的扩增方式,载体的类型,应用范围：克隆载体、表达载体。应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体。,克隆载体(cloning vector),用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。,表达载体(expression vector),使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。,穿梭载体(shuttle vector),又称双功能载体，能在两种不同的生物体内复制的载体。同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。,第二节 质粒,质粒的基本特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并,被稳定遗传的一类核酸分子；绝大多数的质粒是DNA型,质粒常见于原核细菌和真菌中,质粒DNA的分子量范围：1-200 kb,天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。,Plasmid chromosome,绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA,质粒,质粒的基本特征,1.质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,质粒DNA的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为,两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒 1-5 拷贝 stringent plasmid,松弛型复制控制的质粒 10-60 拷贝 stringent plasmid,质粒,质粒的基本特征,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制引物与模板的结合,ori,E.coli ColE1 plasmid,复制方向,rop,（+）,Rop,RNA II,RNA I,3,5,5,3,RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物,质粒,质粒的基本特征,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Cop,Rep,质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系,质粒,质粒的基本特征,2.质粒的不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于,一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,粒组成不相容性群。,亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。,质粒,质粒的基本特征,质粒的不相容性：分子机制,两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种,拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，,两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的,拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，,因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一,细胞内(亲和性质粒),其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势,质粒,质粒的基本特征,3.质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到,另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等,如Col、R的其它成员,非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用,值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒,的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和,mob 基因决定,由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。在基因工程应用的是重组缺陷型（rec）的质粒和菌株。,质粒,质粒的基本特征,4.质粒的重组性,质粒,质粒的基本特征,5.携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这,使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,利用抗性基因进行重组子的筛选,质粒基因编码的特性,Fertility/F质粒：只含有tra基因，除了促进接合转移外没有其他功能。Resistance/R质粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因。如RP4，发现于假单胞杆菌。Col 质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于E.coli 中的CoE1。降解质粒（Degradative plasmids）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。致瘤质粒（Virulence plasmids）：农杆菌Ti质粒。,天然存在的两种质粒colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制20-30/cellpSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell，标记基因为Tcr,质粒,质粒的构建,理想的质粒载体应具备的条件,分子量较小。松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有一个强的选择标记。具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。能够导入寄主细胞，具备转化的功能。操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质粒载体。,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件,质粒人工构建的目的,方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。,构建质粒载体应遵循的原则,选用合适的出发质粒正确获得构建质粒克隆载体的元件根据要转化的受体细胞的特性，组装合适的选择标记基因。构建质粒表达载体，选用合适的启动子。力求构建过程简单化,质粒,质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因,低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因,温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker,整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合,穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆,表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,优点：分子量小：4363bp,容易纯化。含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I,Pvu I,Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I,Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素，可达到1000-3000拷贝。,缺点：有被动迁移的可能，不够安全。抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18/19：,拷贝数 2000-3000/cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18/19：正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,pUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个小片段上。,pUC18的优点：1）突变位点位于复制起点，提高了拷贝数。2)重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal,IPTG，节约了一半的时间。3）多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不必连接linker。4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和体外定点突变。,质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,pGEM-3Z：,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,用于外源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3E,PSP6,酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli BL21（DE3）等,在重组的pGEM3Z载体中加入相应的RNA聚合酶，可以发生外源基因转录。,质粒,质粒DNA的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：,氯化铯密度梯度离心法,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱溶法,质粒DNA纯度底、快速、操作简便,沸水浴法,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,质粒,质粒DNA的分离纯化,氯化铯密度梯度离心法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加CsCl和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取cccDNA,稀释沉淀cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,质粒载体总体评价,操作简便克隆容量有限（10kb）,第三节 噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染,宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏,起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工,程的有用载体：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体的生物学特性：生物结构,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个核苷酸,l-DNA上至少有61个基因,约有20kb的区域为为噬菌体生长非必需的，可以缺失或被外源DNA片段所取代。,l 噬菌体生物学特性：生物结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l-DNA,野生型入噬菌体DNA为双链线性分子黏性末端(cohesive end)：线性分子左右两端各有12bp组成的5端突出的粘性末端，DNA进入宿主细胞后黏性末端连接形成环DNA分子。cos位点(cohesive end site)：指在连接酶的作用下，连接上述黏性末端结合形成的双链DNA区段。又称黏性末端位点。l噬菌体DNA分子上有56种限制性核酸内切酶识别位点。温和噬菌体，易于在溶源生长保存，在溶菌生长增殖。,l 噬菌体生物学特性：生物结构,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性：感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性：感染周期,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围为原DNA的75-105%,即 36-51 kb,D,A,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性：溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小：,0-14 kb,（51 37）,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点,野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不,利于重组操作，必须删除至1-2个,同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一,些单一的酶切位点,除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶,位点,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记,与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此,加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容,l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记 imm434,imm434基因编码一种阻止l-噬菌体,进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记,基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶,原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；,当外源DNA插入到标记基因中，基因灭,活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成,透明斑,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记 lacZ,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化,无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基,因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能,合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产,生蓝色透明斑,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：构建琥珀密码子的突变体,琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的主要类型：,插入灭活型载体,Charon2、Charon6、lgt11,取代型载体,lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40,正选择型载体,lEMBL1、lL47、l1059,野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），,这种生长抑制表型受l-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外,源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌,体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA重组分子的体外包装：,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA及其重组分子的分离纯化：,将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期,加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时,用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒,密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解,超速离心，沉淀噬菌体,苯酚抽提，释放l-DNA,乙醇或异丙醇沉淀l-DNA,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA作为载体的优点：,l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量,重组l-DNA分子的筛选较为方便,重组l-DNA分子的提取较为简便,l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达,外源基因,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13噬菌体的生物学特性：生物结构,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长6407个核苷酸,M13 DNA上至少有10个基因,2700个外壳蛋白分子,M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13噬菌体的生物学特性：感染周期,（+）DNA,RFDNA,RFDNA,RFDNA,-DNA,II,V,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13 DNA载体的构建：,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型M13RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13mp系列载体,lacZ,polylinker,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13 DNA载体的特点：,使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外,这在DNA定向突变中非常有用,M13重组分子筛选简便,被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混,浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊,斑的混浊度亦越大,但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb,噬菌体或病毒DNA,与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病,毒基因组DNA。,动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病,毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：,单链DNA病毒,双链DNA病毒,单链RNA病毒,双链RNA病毒,RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，,这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。,考斯质粒与噬菌粒,l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和,1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，,考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA,的装载量。,在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，,就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序,列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时,又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这,便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒,和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内,不能形成噬菌体颗粒。,考斯质粒与噬菌粒,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的构建：,考斯质粒是一类人工构建的含有,1978年Collins和Hohn发明构建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和质粒复制子的,特殊类型的载体,cos site-carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段+pBR322片段,装载范围为31-45 kb,考斯质粒与噬菌粒,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的特点：,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,考斯质粒与噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,噬菌粒载体的特点：,噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子,以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体,能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞,装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA,考斯质粒与噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,重要的噬菌粒载体：pUC118/119,pUC118 pUC18+M13间隔区 IG,pUC119 pUC19+M13间隔区 IG,500 个拷贝,3200 bp,MCS,lacZ,lacI,ori,Apr,M13-MG,pUC118/119,表示M13辅助噬菌体DNA,考斯质粒与噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体,pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT7,2958 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,f1-ori,pBluescript,PT3,噬菌体启动子PT3和PT7强化外,源基因的转录,提取出来的单链DNA重组分子,在噬菌体RNA聚合酶的存,在下，又可实现外源基因,的体外转录,人造染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百,甚至上千 kb 的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载,量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳,定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外,源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，,它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人造染色体（BAC）,酵母人造染色体（YAC）,人造染色体载体,细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上,构建的，其装载量范围在50-300 kb之间,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,pBACs主要适用于：,克隆大型基因簇（gene cluster）结构,构建动植物基因文库,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列,酵母人造染色体的构建：,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子,酵母染色体的中心粒序列,酵母系统的选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的选择标记,YAC载体的装载量为350-400 kb,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,酵母人造染色体的使用：,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,C 用于基因转移的受体菌或细胞,3 基因工程的基本条件,各种基因工程受体的特性,实验室常用的基因工程受体,受体细胞应具备的条件,受体细胞应具备的条件,限制性缺陷型,外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）,重组整合缺陷型,用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）,具有较高的转化效率,具有与载体选择标记互补的表型,感染寄生缺陷型,防止重组细菌扩散污染，生物武器除外,各种基因工程受体的特性,大肠杆菌,遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定,适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌,产结构复杂、种类繁多的内毒素,各种基因工程受体的特性,枯草杆菌,遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素,适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌,遗传欠稳定，载体受体系统欠完备,各种基因工程受体的特性,链霉菌,抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素,主要用于抗生素生产菌株的改良,遗传不稳定，生长相对缓慢,各种基因工程受体的特性,酵母菌,具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定,适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌,内源性蛋白产物种类繁多且含量高,各种基因工程受体的特性,昆虫细胞（家蚕）,具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定,适用于真核生物基因的高效表达,DNA重组操作系统欠完善,各种基因工程受体的特性,哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）,与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统,适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体,细胞培养条件苛刻，生长缓慢,各种基因工程受体的特性,植物细胞（拟南芥菜、烟叶）,农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用,适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良,遗传操作繁琐,实验室常用的基因工程受体,大肠杆菌,用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654,酵母菌,哺乳动物细胞 CHO,毕赤酵母,啤酒酵母,