Rainbow和UV beads演示质控(QC)和软件操作练习(三根激光).doc

Rainbow beads演示质控（QC）和Diva软件操作练习仪器质量控制（QC）可监测一定时间内仪器状态的稳定性。下面将介绍如何运行质控微球，调整光电倍增管（PMT）的电压，从而追踪一定时间内PMT电压的波动，以及如何确认激光延迟时间和面积因子。分析30-60次QC数据以判断其趋势。在做仪器QC的时候，尽可能保证多参数的稳定性。比如，尽量使用同一种微球，同样的批号，同样的鞘液压力和同样的样本流速。如果需要改变鞘液压力，那么您可以考虑在每一种压力条件下，单独建立一个“Experiment (实验)”。1、样本制备（2管）： 向1ml鞘液中加入2滴混合均匀的Rainbow荧光微球（BD Pharmingen Cat. No.556291）；检测488nm蓝色激光和633nm红色激光 向另一管1ml鞘液中加入2滴混合均匀的UV荧光微球（BDIS Cat. No. 344669）；检测407nm紫色激光 上机检测前充分混匀微球。2、 在“浏览器（browser）”里建文件夹（QC）和实验组（beads），样本（日期），2个采集管（Rainbow和Violet），并重命名（选中后，点右键Rename重命名），将“通用工作页面（Global sheet）”命名为Rainbow，再添加一个“通用工作页面（Violet）”。3、 选择Instrument>Instrument Configuration，确保当前的仪器设置包含合适的参数，选择FACSAria Class。4、 将“浏览器”的采集箭头选中采集管，点击“仪器框（instrument）”的“参数（parameter）”页面。 除FSC、SSC散射光参数外，删除不必要的荧光参数，保留以下三个荧光参数： FITC；检查488nm激光； APC；检查633nm激光； DAPI；检查407nm激光。所有参数均选择线性，所有参数均选A面积信号，FSC和荧光参数还需选择H高度信号。5、 在“通用工作页面Rainbow”上建获取模板： 一共画8个图：第一个为双参数散点图（Dot Plot），后7个为单参数直方图（histogram）。选中工作页面工具栏中的绘图工具，在空白页面上单击，即出现相应图形，再调整大小。 第一个图，横轴FSC-A，纵轴SSC-A，在横轴和纵轴均100,000左右位置，设单个微球的矩形门（rectangle gate）P（Parent）1； 点击Ctrl，一起选中后七个图，单击右键，选择“Show Population（细胞群体级别图）”中的P1，即后七个图仅显示P1门内颗粒；右键单击任何一张图，选择“Show Population Hierarchy（显示细胞群体级别）”，出现该图，以明确层层包含的细胞归属级别。当一个“门”设置完毕之后，可以手动改变其内细胞群体的颜色。双击“细胞群体级别图”上的颜色盒，从菜单中选择新颜色。 第二个图，横轴FSC-A，在横轴100,000左右位置，做间隔门（interval gate）P2；第三个图，横轴FSC-H，在横轴100,000左右位置，做间隔门P3； 第四个图，横轴SSC-A，在横轴100,000附近，做间隔门P4； 第五个图，横轴FITC-A，在横轴100,000附近，做间隔门P5； 第六个图，横轴FITC-H，在横轴100,000附近，做间隔门P6； 第七个图，横轴APC-A，在横轴100,000附近，做间隔门P7； 第八个图，横轴APC-H，在横轴100,000附近，做间隔门P8。 选择这八个图，单击信息查看窗口内的“Title (标题)”页面，选中“Tube (采集管)”和“Population (细胞群体)”复选框，在这八个图的标题位置均显示此两项。在细胞群体级别图上，对P1-P8进行重命名（选中，再点一下），例如single beads，FSC-A，SSC-A，FITC-A，FITC-H等。 显示统计图：右键单击任何一张图，选择“Create Statistics View（显示统计结果）”。右键单击统计图，选择“Edit Statistics View（编辑统计结果）”。单击“Edit Statistics View”窗口：“Header（表头）”页面，选择需要项目。“Population（细胞群体）”页面，可以不选择“# Events（细胞数）”和“Parent（%母细胞群体，即门内细胞群体）”。因细胞群体级别图中已显示这几项。“Statistics (统计)” 页面，仅选择所有实验涉及到的参数的“Mean (平均值)”选项。 6、 在“通用工作页面Violet”上建获取模板： 一共画3个图：第一个为散点图，后2个为直方图。 第一个图，横轴FSC-A，纵轴SSC-A，设单个微球的矩形门P1； 点击Ctrl，一起选中后2个图，单击右键，选择“Show Population”中的P1；右键单击任何一张图，选择“Show Population Hierarchy（显示细胞群体级别）”。 第二个图，横轴DAPI-A，在横轴100,000左右位置，做间隔门P2；第三个图，横轴DAPI-H，在横轴100,000左右位置，做间隔门P3。 选择这三个图，单击信息查看窗口内的“Title (标题)”页面，选中“Tube (采集管)”和“Population (细胞群体)”复选框。在细胞群体级别图上，对P1-P3进行重命名（选中，再点一下），single beads，DAPI-A，DAPI-H等。 显示统计图：右键单击任何一张图，选择“Create Statistics View”。右键单击统计图，选择“Edit Statistics View”，在“Statistics”页面，选择DAPI-A和DAPI-H的“Mean”选项。7、检测488nm蓝色激光： 将第一管Rainbow微球放在流式细胞仪上，确认使用“Rainbow通用工作页面”。 确认“浏览器”中的绿色数据采集箭头指向Rainbow检测管；然后单击“Acquisition Control (获取控制)”窗口里的“Load (上样)”键。载样端口便上升进入进样仓。样品管进入进样仓后，获取程序自动启动。将流速设置为1.0。调整过程中交替点击“Acquire/restart”，更新图形和统计。· 看通用工作页面中的第三（FSC-H）、第四（SSC-A）张图，点击仪器框的参数页面调整FSC和SSC电压，使微球峰位于FSC、SSC直方图的靶值处（100,000，看统计图中显示）。同时调整图一（FSC-ASSC-A）中P1的位置和大小，使其仅圈中单个微球。在数据采集控制窗口，将显示的颗粒数（“Events to display”）设为500。数据统计就会更新的更快，从而统计框中的mean值与图中的显示步调更快地一致。 · 若有必要，点击仪器框的阈值（threshold）菜单调整FSC阈值。 检查FSC的面积因子。 在统计图中检查第二张图P2中FSC-A和第三张图中P3中FSC-H的mean。如果这两种信号强度是相等的，那么就没有必要调节面积因子。如果二者不相等，按照下列步骤进行调节：l 单击在“Instrument (仪器)”窗口中的“Laser (激光)”页面。l 在“FSC Area Scaning（面积因子）”中选定当前的数值，然后输入一个新的数值。l 在直方图上观察数值变更后的结果。l 继续调节面积因子，直到FSC-A和FSC-H的信号强度相等。 检查蓝光的面积因子。· 看第六张图FITC-H，点击仪器框的参数页面，优化调整FITC电压，使微球峰位于相应荧光信号图的靶值处（100,000）。· 在统计图中检查第五张图FITC-A和第六张图FITC-H的平均荧光强度。如果这两种信号强度是相等的，那么就没有必要调节面积因子。如果二者不相等，按照下列步骤进行调节：l 单击在“Instrument (仪器)”窗口中的“Laser (激光)”页面。l 在“Area Scaning（面积因子）”中选定当前的数值，然后输入一个新的数值。l 在直方图上观察数值变更后的结果。l 继续调节面积因子，直到FITC-A和FITC-H的信号强度相等。 面积因子 调节前（左）和后（右）的蓝色激光面积因子8、检测633nm红色激光： 看“Rainbow通用工作页面”中第八张图APC-H，优化调整APC电压，使微球峰位于相应荧光信号图的靶值处（100,000）。 检查红光的面积因子。在统计图中检查第七张图APC-A和第八张图中APC-H的平均荧光强度。如果这两种信号强度是相等的，那么就没有必要调节面积因子。如果二者不相等，按照7中步骤进行调节，直到APC-A和APC-H的信号强度相等。 最优化红色激光的激光延迟时间设置。l 在“Instrument (仪器)”窗口内选择“Laser (激光)”页面。l 在“Delay”中以“0.1”的数值间隔逐渐调节红色激光的激光延迟时间数值，使第七张图APC-A的平均荧光信号强度达到最高值，提示该激光延迟时间已设置好。激光延迟时间 调试结束后，在获取控制框里选择获取全部10000个微粒停止，点击获取控制框的“Record”-记录数据；该窗口出现蓝色进程显示条。 数据记录完成后，单击“Acquisition Control (获取控制)”窗口上的“Unload (卸载)”键，取下管子。9、检测407nm红色激光： 将第二管UV微球放在流式细胞仪上。 确认“浏览器”中的绿色数据采集箭头指向Violet检测管；确认使用“Violet通用工作页面”；上样。 如需要，调节FSC和SSC电压值，使第一张图中的P1圈中单个微球。若有必要调整FSC阈值。 看第三张图DAPI-H，优化调整DAPI电压，使微球峰位于相应荧光信号图的靶值处（100,000）。 检查面积因子。在统计图中检查第二张图DAPI-A和第三张图DAPI-H的平均荧光强度。如果这两种信号强度是相等的，那么就没有必要调节面积因子。如果二者不相等，按照7中步骤进行调节，直到DAPI-A和DAPI-H的信号强度相等。 最优化紫色激光的激光延迟时间设置。l 在“Instrument (仪器)”窗口内选择“Laser (激光)”页面。l 在“Delay”中以“0.1”的数值间隔逐渐调节紫色激光的激光延迟时间数值，使第二张图P2中DAPI-A的平均荧光信号强度达到最高值，提示该激光延迟时间已设置好。 调试结束后，选择获取全部10000个微粒停止，记录数据，取下样本管。10、在“Instrument”菜单下选择Instrument>Instrument Status Report，打印或记录各激光和荧光的设置，存档，推荐每23周进行一次QC，使得面积因子和激光延迟时间处于正确设置状态。11、再次使用QC管： 选择Edit>User Preferences，取消Remove tube-specific settings on duplicate选项，保证仪器条件与QC管一起复制。 在“浏览框”中双击打开QC文件夹下的实验组，右键单击上一次的样本，然后选择“Duplicate Without Data”（即不包含数据复制，仅保留仪器条件），一个新的质控采集管将出现在这一新的样本目录下，用当前的年月日对复制的QC样本命名，如上所述运行QC微球。因为本次QC开始运行的是上次QC的条件，所以PMT只需微调即可达到靶值。追踪30-60次QC数据，监测PMT的变化趋势。