任务三细菌菌落总数的测定.ppt

,项目三 原料乳入厂验收检验 任务一原料乳感官检验任务二原料乳理化指标检验 任务三原料乳微生物指标检验,任务三原料乳微生物指标检验 菌落总数的测定(GB 4789.22010),教学目标 1、了解菌落总数测定的意义2、学习原料乳中菌落总数测定方法和原理 3、掌握原料乳菌落总数测定检验程序、操作步骤及结果报告教学内容 一、原料乳微生物概述 二、平板计数法检验原料乳菌落总数 三、菌落总数其他常用的检验方法,一、原料乳微生物概述,(一)乳中微生物的种类及贮藏中的变化 1、乳中微生物的种类(1)产酸菌。指能分解乳糖产生乳酸的细菌 链球菌类：乳酸链球菌、乳酪链球菌、粪链球菌、嗜热链球菌、液化链球菌。乳酸杆菌类：嗜酸乳杆菌、保加亚利乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌。明串珠菌属：其次,(2)产气菌。这类微生物能使鲜乳发酵生成酸和产气，能使牛乳凝固，产生多孔气泡，并产生异味和臭味。大肠菌群，主要有大肠杆菌和产气杆菌，这类细菌除产酸产气外，还能分解蛋白质，产生异味，评价乳细菌污染程度的指标之一。丁酸菌类，主要有丁酸梭菌、魏氏梭菌等，使鲜乳产酸产气，其中的丁酸，气味恶臭，所产气体量很大，可使凝固的鲜乳裂成碎块，形成暴烈发酵现象。丙酸细菌，也能使鲜乳产酸产气，丙酸菌的发酵可使干酪形成网眼，并产生特殊的芳香风味，对干酪的品质有良好的影响。,(3)分解蛋白质发生胨化的细菌 假单胞菌属，分解蛋白质能力极强，可将蛋白质形成胺和氨，并产生不良气味。液化粪链球菌、蜡样芽胞杆菌、变形杆菌等使乳产酸与蛋白质分解同时进行。产碱杆菌属、黄杆菌属、微球菌属等低温菌，能在低温条件下使蛋白质分解，从而使冷藏乳腐败变质并产生苦味。,(4)产碱菌。使鲜乳呈碱性的细菌 主要有粪产碱菌和粘乳产碱菌，粪产碱菌不常存在于肠道内，由粪便混入鲜乳中；粘乳产碱菌常存在于水中，故通常由水混入到鲜乳中，使鲜乳变为粘稠。这两种纽重子笔分解柠檬酸盐为碳酸盐，而使鲜乳呈碱性反应。,(5)使乳变色的细菌 深蓝色假单胞菌产生的色素，在中性或碱性乳中呈灰色，在酸性乳中呈蓝色。黄假单胞菌在乳中繁殖时，分解乳中的脂肪、蛋白质并产生淡黄色色素，从而使乳呈黄色，此外黄杆菌属的细菌增后也可使乳呈黄色。粘质沙雷氏菌在乳中纯培养可引起红乳，但通常情况，由于其它细菌阢下量繁殖抑制了该菌生长，故红乳很少见。,(6)脂肪分解菌。能使甘油酯分解生成甘油和脂肪酸的菌群。主要有：荧光极毛杆菌、蛇蛋果假单胞菌、无色解脂菌、解脂小球菌、干酪乳杆菌、白地霉、黑曲霉、大毛霉等。脂肪分解菌。能使甘油酯分解生成甘油和脂肪酸的菌群。多是使牛乳和乳制品变质的细菌，尤其对稀奶油和奶油危害更大。一部分脂肪分解菌在干酪生产上为有益菌。,(7)酵母菌和霉菌 鲜乳中常见酵母为脆壁酵母、膜脯毕赤氏酵母、汉逊氏酵母和圆酵母属及假丝酵母属等。脆壁酵母是生产牛乳酒、酸马奶酒巴的珍贵菌种。毕赤氏酵母能使低浓度的酒精饮料表面形成干燥皮膜。膜脯毕赤氏酵母主要存在于酸凝乳及发酵奶油中。圆酵母属能使乳制品产生酵母味，并能使干酪和炼乳罐头膨胀。霉菌主要有根霉、毛霉、曲霉、青霉、串珠霉等，大多数属于有害菌。与乳品有关的主要有白地霉、毛霉及根霉属等，如生产卡门墙尔干酪、罗奎福特干酪和青纹干酪时需要依靠霉菌。,(8)鲜乳中可能存在的病原菌 常见的有结核分支杆菌、副结核分枝杆菌，布氏杆菌、溶血性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无孚L链球菌等。,鲜乳的变质及其相关微生物,2、牛乳在室温下贮存时微生物的变化 新鲜牛乳在杀菌前都有一定数量的、不同种类的微生物存在，如果放置在室温（10-21）下，会因微生物在乳液中活动而逐渐使乳液变质。室温下微生物的生长过程可分为以下几个阶段(1)抑制期(2）乳酸链球菌期(3）乳酸杆菌期(4）真菌期(5）胨化菌期,(1)抑制期 特征：牛乳中均含有多种抗菌性物质，它在最初阶段抑制牛乳中的微生物，使其中的微生物反而减少。,(2）乳酸链球菌期 生鲜牛乳过了抑菌期后，抗菌物质减少或消失，其内的微生物迅速繁殖，尤其是细菌的繁殖占绝对优势，分解出酸性物质，使乳酸度升高，致使牛乳凝块出现。这些细菌主要是乳链球菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和一些蛋白分解菌等，特别是乳链球菌生长繁殖特别旺盛。乳链球菌分解牛乳中的乳糖产生乳酸，牛乳的酸度不断升高。如大肠菌增殖，将会有产气现象出现。由于牛乳酸度不断升高，其他腐败细菌的活动就受抑制。当酸度升高至一定限度时（pH4.5)，乳链球菌本身受到抑制不再继续繁殖，相反会逐渐减少，特征：这时就有牛乳凝块出现，有时有气体产生。,(3）乳酸杆菌期 乳酸链球菌在牛乳中繁殖，使牛乳PH 下降至6 左右这时乳酸杆菌的活动力逐渐增强。当PH继续下降至4.5以下时，由于乳酸杆菌耐酸力较强，尚能继续繁殖并产酸。此时还有非常耐酸的丙酸菌、孢子形成菌等出现，它们会消耗部分乳酸而形成一些优势菌。特征：乳液中可出现大量乳凝块，并有大量乳清析出。,(4）真菌期 当酸度继续下降至PH3.53 时，绝大多数微生物被抑制甚至死亡，仅酵母和霉菌尚能适应高酸性的环境，并能利用乳酸及其他一些有机酸，于是形成优势菌。特征：由于酸的被利用，乳液的酸度会逐渐降低，使乳液的PH不断上升接近中性。,(5）胨化菌期 经过上述几个阶段的微生物活动后，乳液中的乳糖大量被消耗，残余量已很少，在乳中仅是蛋白质和脂肪尚有较多的量存在。因此，适宜于分解蛋白质和脂肪的细菌在其中生长繁殖。这样就产生了乳凝块被消化（液化）、乳液的pH 逐步提高向碱性方向转化，并有腐败的臭味产生的现象。这时的腐败菌大部分是属于芽胞杆菌属、假单胞菌属以及变形杆菌属的一些细菌。特征：乳凝块被消化（液化）、乳液的pH 逐步提高向碱性方向转化，并有腐败的臭味产生的现象。,(二)菌落总数定义及检验意义 乳中细菌数量的表示方法主要有两种：1、菌落总数 2、细菌总数,二、平板计数法检验原料乳菌落总数一、原理,1、菌落总数 是指一定数量和面积的食品检样，在一定条件下(如样品的处理、培养基种类、培养时间、温度等)进行培养，使适应该条件的每一个活菌必须而且只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得到的菌落总数量。通常以1g或1mL或1cm2样品中所含的菌落数量cfu(菌落形成单位)来表示。一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、pH、是否需要氧气等。目前中国的食品标准中规定细菌总数实际上是指菌落总数。,菌落总数：并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。,菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。,食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。,2、细菌总数 指一定数量或面积的食品检样，经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1 g或1 mL样品中的细菌总数来表示。,二、材料,1、食品检样 2、培养基 平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 3、其它 无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培养箱等。,四、流程,1、检样 2、做几个适当倍数的稀释液3、选择23个适宜稀释度各1 mL,分别加入灭菌平皿内 4、平皿内倾注1520 mL琼脂培养基，混匀 5、36 1培养482小时或（242）小时6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量7、计算菌落总数 报告,五、步骤,(一)取样、稀释和培养 1、以无菌操作取检样25g（mL），放于225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体和半固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以800010000r/min的速度处理12min，制成1:10的均匀稀释液。,2、用1 mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，振摇试管或反复吹打混合均匀，制成1:100的稀释液。,3、另取1 mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1 mL吸管。,4、根据标准要求或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。同时分别取1ml稀释液（不含样品）加入两个灭菌平皿内作空白对照。,5、稀释液移入平皿后，将冷却至46琼脂培养基注入平皿约1520ml，并转动平皿，混合均匀。,6、待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h，水产品301温箱内培养723h。如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4毫升），凝固后培养。,（二）菌落记录方法 做平板菌落数记录时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不要超过24h。,1、平皿菌落数的选择 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿，大于300的可记为多不可计。,2、其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。,3、当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。,（三）菌落总数的计算 1、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。,2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按如下公式计算：N=C/（n1+0.1n2）d（1)式中：N 样品中菌落数；C 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；nl 第一个适宜稀释度平板数；n2 第二个适宜稀释度平板数；d 稀释因子（第一稀释度）。,例如：稀释度 1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）菌落数 232，244 33，35 232+244+33+35(2+0.12)10-2=544/0.022=24727 四舍五入表示为:2.5 104,3、若所有稀释度的平板菌落数均300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算。,4、若所有稀释度平板菌落数均30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数计算。5、若所有稀释度平板均无菌落生长，则应按1乘以最低稀释倍数计算。,6、若所有稀释度均不在30300之间，有的300，有的又30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。,（四）菌落计数报告方法,1、菌落数在1100时，按四舍五入报告两位有效数字。2、菌落数 100时，第三位数字按四舍五入计算，取前面两位有效数字，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。,3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。4、若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。5、称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。,注意事项,1、无菌操作 操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。,2、采样的代表性 如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。,3、稀释液 样品稀释液主要是灭菌生理盐水，或磷酸盐缓冲液（或0.1蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。,4、每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。5、倾注用培养基应在46水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。,6、倾注培养基的量规定不一，从1220ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。,7、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。,8、培养温度一般为37（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15。,9、为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4环境中放置，以便计数时作对照观察。,六、结果,1、将实验测出的样品数据以表格的方式报告。2、对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。,报告方式,七、思考,1、什么是细菌菌落总数（cfu）？2、影响杂菌总数准确性的因素有哪些？3、在食品卫生检验中，为什么要以细菌菌落总数为指标？4、为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在461的温度？,酱油（GB/T2717-2003）：细菌菌落总数：30000 CFU/mL大肠菌群：30MPN/100mL肠道致病菌：不得检出,全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999）：特级 一级 二级细菌菌落总数：20000 30000 50000（CFU/ml）大肠菌群 40 90 90（MPN/100g）肠道致病菌：不得检出 不得检出 不得检出,巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）细菌菌落总数：30000 CFU/mL大肠菌群：90 MPN/100mL肠道致病菌：不得检出,生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）菌落总数cfu/ml：100总大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出耐热大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出大肠埃希氏菌cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出,瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准(GB 17324-2003)细菌菌落总数cfu/ml：20大肠菌群MPN/100ml：3致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出,