仪表与传感器课件第9章.ppt

1,第 9 章 生物传感技术,9.1 概述9.2 生物传感技术的分子 识别原理与技术9.3 生物传感仪器技术及其应用,9.1 概述,生物传感技术是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术，在生物医学、环境监测、食品、医药及军事医学等领域有着重要应用价值。生物传感器有以下共同的结构：包括一种或数种相关生物活性材料及能把生物活性表达的信号转换为电信号的物理或化学换能器，二者组合在一起，用现代微电子和自动化仪表技术进行生物信号的再加工，构成各种可以使用的生物传感器分析装置、仪器和系统。,生物传感器的特点：（1）采用固定化生物活性物质作催化剂，价值昂贵的试剂可以重复多次使用，克服了过去酶法分析试剂费用高和化学分析繁琐复杂的缺点。（2）专一性强，只对特定的底物起反应，而且不受颜色、浊度的影响。（3）分析速度快，可以在一分钟得到结果。（4）准确度高，一般相对误差可以达到1。（5）操作系统比较简单，容易实现自动分析。（6）成本低，在连续使用时，每例测定仅需要几分钱人民币。（7）有的生物传感器能够可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生。,9.1.1 生物传感器的工作原理,以生物活性物质为敏感材料做成的传感器叫生物传感器。它以生物分子去识别被测目标，然后将生物分子所发生的物理或化学变化转化为相应的电信号，予以放大输出，从而得到检测结果。生物传感器的选择性与分子识别元件有关，取决于与载体相结合的生物活性物质。,5,为了提高生物传感器的灵敏度，可利用化学放大功能。所谓化学放大功能，就是使一种物质通过催化、循环或倍增的机理同一种试剂作用产生出相对大量的产物。传感器的信号转换能力取决于所采用的转换器。根据器件信号转换的方式可分为：直接产生电信号；化学变化转换为电信号；热变化转换为电信号；光变化转换为电信号；界面光学参数变化转换为电信号。,9.1.2 生物传感技术的发展历史,1967年美国的S.J.乌普迪克等制出了第一个生物传感器葡萄糖传感器。现已发展了第二代生物传感器（微生物、免疫、酶免疫和细胞器传感器），研制和开发第三代生物传感器，将生物技术和电子技术结合起来的场效应生物传感器。近年来，随着生物科学、信息科学和材料科学发展的推动，生物传感器技术飞速发展。可以预见，未来的生物传感器将具有以下特点：（1）功能多样化（2）微型化（3）智能化与集成化（4）低成本、高灵敏度、高稳定性和高寿命,9.1.3 生物传感器的分类,生物传感器主要有下面三种分类命名方式：（1）根据生物传感器中分子识别元件即敏感元件的不同，生物传感器可分为酶传感器（固定化酶）、微生物传感器（固定化微生物）、免疫传感器（固定化抗体）、基因传感器（固定化单链核酸）、细胞传感器（固定化细胞器）和组织传感器（固定化生物体组织）等。（2）按照传感器器件检测的原理分类，可分为：热敏生物传感器、场效应管生物传感器、压电生物传感器、光学生物传感器、声波道生物传感器、酶电极生物传感器、介体生物传感器等。（3）按照生物敏感物质相互作用的类型分类，可分为亲和型和代谢型两种。,9.2 生物传感技术的分子识别原理与技术,酶促反应动力学（kinetics of enzyme-catalyzed reactions）是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。这些因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH值、温度、抑制剂和激活剂等。但必须注意，酶促反应动力学中所指明的速度是反应的初速度，因为此时反应速度与酶的浓度呈正比关系，这样避免了反应产物以及其他因素的影响。,9.2.1 酶反应,9,酶促反应具有一下几个特点：酶促反应具有一般催化剂的性质；加速化学反应的进行，而其本身在反应前后没有质和量的改变，不影响反应的方向，不改变反应的平衡常数；酶促反应具有极高的催化效率；酶促反应具有高度的专一性。一种酶只作用于一类化合物或一定的化学键，以促进一定的化学变化，并生成一定的产物，这种现象称为酶的特异性或专一性。受酶催化的化合物称为该酶的底物或作用物。酶对底物的专一性通常分为绝对特异性、相对特异性和立体异构特异性。,1.酶浓度对反应速度的影响 在一定的温度和pH值条件下，当底物浓度大大超过酶的浓度时，酶的浓度与反应速度呈正比关系。,酶浓度对反应初速度的影响,2.底物浓度对反应速度的影响 在酶的浓度不变的情况下，底物浓度对反应速度影响的作用呈现矩形双曲线。在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急聚加快，两者呈正比关系，即一级反应。随底物浓度升高，反应速不呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，表现为0级反应。此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶被底物所饱和。,12,3.pH值对反应速度的影响 酶反应介质的pH值可影响酶分子的解离程度和催化基团中质子供体或质子受体所需的离子化状态，也可影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶与底物的结合。,下表 一些酶的最适pH值 溶液的pH值高于和低于最适pH值时都会使酶的活性降低，远离最适pH值时甚至导致酶的变性失活。,温度对唾液淀粉酶活性影响,14,4.温度对反应速度的影响 化学反应的速度随温度增高而加快。但酶是蛋白质，可随温度的升高而变性。左图所示为温度对唾液淀粉酶活性影响,5.抑制剂对反应速度的影响 凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称作酶的抑制剂。使酶变性失活（称为酶的钝化）的因素如强酸、强碱等，不属于抑制剂。通常抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。6.激活剂对酶促反应速度的影响 能使酶活性提高的物质，都称为激活剂，其中大部分是离子或简单的有机化合物。,16,9.2.2 微生物反应,利用微生物进行生物化学反应的过程称为微生物反应过程，即将微生物作为生物催化剂进行的反应为微生物反应。1.微生物反应和酶反应的共同特点（1）两者都是生物化学反应，反应所需要的环境相似；（2）微生物细胞中包含各种酶，催化所有酶可以催化的反应；（3）两者催化的速度近似。,2.微生物反应的特殊性（1）酶反应需要温和的环境，微生物细胞的膜系统为酶的反应提供了天然的“理想环境”，细胞可以在较长的时间保持一定的催化活性；（2）同一个微生物细胞自身包含数以千计种的酶，显然比单一的酶更适合多底物反应；（3）酶反应需要的辅助因子和能量可以由微生物细胞提供；（4）酶的提纯等成本高，有些酶至今未能完全的提纯，相比之下，微生物细胞来源方便，价格低廉。,18,3.传感器以微生物为敏感元件的不足之处 微生物传感器作为生物传感器的重要组成部分，作为分子识别元件即敏感元件的生物传感器亦存在着自身的不足之处：（1）由于反应过程中往往存在着微生物的生长和死亡，故分析反应的标准不易建立。（2）微生物细胞本身是一个庞大的酶系统，包括自身代谢在内的许多反应并存，难以去除不必要的反应。（3）微生物细胞受环境变化的影响易引起自身生理状态的复杂化，从而导致不期望的反应。,4.微生物反应的分类方式 微生物反应主要有下面三种分类方式（1）按照生物代谢流向，微生物反应可以分为同化作用和异化作用。（2）按照微生物对营养的要求，微生物反应可以分为自养性和异养性。（3）按照微生物反应对氧的需求与否，微生物反应可以分为好氧反应和厌氧反应。,20,免疫指机体对病原生物感染的抵抗能力。可区别为自然免疫和获得性免疫。自然免疫是非特异型的，获得性免疫一般是特异性的，在微生物等抗原物质刺激后才形成，并能与该抗原产生特异性反应。上述各种免疫过程中，抗原与抗体的反应是最基本的反应。,9.2.3 免疫反应,1.抗原（1）抗原的定义 抗原是能够刺激动物体产生免疫反应的物质。抗原有两种性能：刺激机体产生免疫应答反应和与相应免疫反应产物发生异性结合反应。前一种性能称为免疫原性，后一种性能称为反应原性。具有免疫原性的抗原完全抗原，那些只有反应原性，不刺激免疫应答反应的称为半抗原。（2）抗原的分类 通常，根据来源的不同，抗原又可以分为如下几种：天然抗原 人工抗原 合成抗原。合成抗原是化学合成的多肽分子。,22,（3）抗原的理化性状抗原有两种性状：物理性状。完全抗原的分子量较大，通常相对分子质量在1万以上。分子量越大，其表面积相应扩大，接触免疫系统细胞的机会增多，因而免疫原性也就增强。化学组成。自然界中绝大多数抗原都是蛋白质，即可是纯蛋白，也可是结合蛋白。,免疫传感器的种类,（4）抗原决定簇 抗原决定簇是抗原分子表面的特殊化学基团，抗原的特异性取决于抗原决定簇的性质、数目和空间排列。不同种系的动物血清白蛋白因其末端氨基酸排列的不同，而表现出各自的种属性特异。一种抗原常具有一个以上的抗原决定簇，如牛血清蛋白有14个，甲状腺球蛋白有40个。,2.抗体（1）抗体的定义 抗体是由抗原刺激机体产生的特性免疫功能的球蛋白，又称免疫球蛋白。（2）抗体的结构 免疫球蛋白都是由一至几个单体组成，每个单体有两条相同的分子量较大的重链和两条相同分子量较小的轻链组成，链与链之间通过二硫链及非共价键链连接。,免疫球蛋白（Ig）结构模式图,（3）抗体的特性 抗体早已用在免疫检测中，其与相应抗原之间的键连接甚至比酶与其基质之间的连接更加有力，特别是对对应的抗原的连接更是如此。,3.抗原-抗体反应抗原-抗体结合时将发生凝聚、沉淀、溶解反应和促进吞噬抗原颗粒的作用。在溶液中，抗原和抗体两个分子的表面电荷与介质中离子形成双层离子云，内层和外层之间的电荷密度差形成静电位和分子间引力。由于这种引力仅在近距离上发生作用，抗原与抗体分子结合时对位应十分准确。一是结合部位的形状要互补于抗原的形状；二是抗体活性小心带有与抗原决定簇相反的电荷。,26,然而，抗体的特异性是相对的，表现在两个方面：其一，部分抗体不完全与抗原决定簇相对应。其二，即便是针对某一种半抗原的抗体，其化学结构也可能不一致。抗原与抗体结合尽管是稳固的，但也是可逆的。调节溶液的PH值或离子强度，可以促进可逆反应。某些酶能促使逆反应，抗原-抗体复合物解离时，都保持自己本来的特性。,9.2.4 膜技术,膜是指能以特定形式限制和传递各种物质的分隔两相的界面。膜在生产和研究中的使用技术被称之为膜技术，它包括膜分离技术和非分离膜技术。膜分离是利用膜的特殊性能和各种分离装置单元使溶液和悬浮液中的某些组分较其它组分更快地透过，从而达到分离、浓缩的目的。非分离膜技术是指一些具有特殊性能的功能膜的应用及其它一些膜过程。能量转换膜、反应膜、膜蒸馏等，都是属于非分离膜技术。,28,1.膜分离的工作原理 一是根据混合物的质量、体积和几何形态的不同，用过筛的方法将其分离；二是根据混合物不同化学性质。物质通过分离膜的速度取决于进入膜内的速度和由膜的一个表面扩散到另一表面的速度。通过分离膜的速度愈大，透过膜所需的时间愈短，同时，混合物中各组分透过膜的速度相差愈大，则分离效率愈高。,2.膜处理方法(1)微滤（MF）膜技术 微滤膜是以静压差为推动力，利 用筛网状过滤介质膜的筛分作用进行分离。(2)超滤（UF）膜技术 超过滤是以压差为驱动力，利用超滤膜的高精度截留性能进行固液分离或使不同相对分子质量物质分级的膜分离技术。3.纳滤（NF）膜技术 纳滤膜是在反渗透膜的基础上发展起来的，因具有纳米级的孔径故名纳滤。4.反渗透（RO）膜技术 反渗透（又称高滤）过程是渗透过程的逆过程，推动力为压力差，即通过在待分离液一侧加上比渗透压高的压力，使原液中的溶剂被压到半透膜的另一侧。反渗透系统由反渗透装置及其预处理和后处理三部分组成。,5.电渗析（ED）膜技术 电渗析是一个电化学分离过程，是在直流电场作用下以电位差为驱动力，通过荷电膜将溶液中带电离子与不带电组分分离的过程。该分离过程是在离子交换膜中完成的。电渗析系统通常由预处理设备、整流器、自动控制设备和电渗析器等组成。6.渗透蒸发（PV）膜技术 渗透蒸发是一个压力驱动膜分离过程，它是利用液体中两种组分在膜中溶解度与扩散系数的差别，通过渗透与蒸发，达到分离目的的一个过程。7.双极膜（BPM）技术 双极膜是由阴离子交换膜和阳离子交换膜叠压在一起形成的新型分离膜。阴阳膜的复合可以将不同电荷密度、厚度和性能的膜材料在不同的复合条件下制成不同性能和用途的双极膜，如水解离膜，一、二价离子分离膜，防结垢膜，抗污染膜，低压反渗透脱硬膜。,表 几种重要的膜分离过程,8.膜技术的集成应用,每一种膜技术都有其特定的能和适用范围能够解决一定的分离问题，但是在实际生产过程中仅仅依靠一种膜技术完成例如废水深度处理或精细物料分离之类的任务，其结果往往难以令人满意。集成各种膜技术，优化各种膜的分离性能，可以达到一种膜技术根本无法实现的效果。几种常用的膜集成技术见右表。,几种常见的膜集成技术及应用,9.3.1 酶传感器,酶传感器是将酶作为生物敏感基元，通过各种物理、化学信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应所产生的与目标物浓度成比例关系的可测信号，实现对目标物定量测定的分析仪器。酶传感器是由固定化的生物敏感膜和与之密切结合的换能系统组成，它把固化酶和电化学传感器结合在一起，因而具有独特的优点：（l）它有不溶性酶体系的优点，也有电化学电极的高灵敏度；（2）由于酶的专属反应性，使其具有高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。,9.3 生物传感器仪器技术及其应用,34,1.酶传感器的基本结构 酶传感器的基本结构单元是由物质识别元件和信号转换器组成.当酶膜上发生酶促反应时，产生的电活性物质由基体电极对其响应。基体电极的作用是使化学信号转变为电信号，从而加以检测，基体电极可采用碳质电极、Pt电极及相应的修饰电极。,2.酶传感器的工作原理 当酶电极浸入被测溶液，待测底物进入酶层的内部并参与反应，大部分酶反应都会产生或消耗一种可被电极测定的物质，当反应达到稳态时，电活性物质的浓度可以通过电位或电流模式进行测定。因此，酶传感器可分为电位型和电流型两类传感器。基团之间形成化学共价键连接，从而使酶固定的方法；交联法：将传感器表面预先组装上一层具有特定基团的载体膜，再通过偶联活化剂分别以羧基氨基键形式或席夫碱形式等将酶键合到电极表面。,36,3.酶的固定方法酶的固定是相当重要的一个环节。合适的固定化方法应当满足：（1）酶固定化后活性应尽可能少受影响，（2）固定化方法对被测对象的传质阻力小（3）酶固定化牢固，不易洗脱。酶固定化方法有多种，大致可分为以下四类：吸附法：将酶通过静电引力、范德华力、氢键等作用力固定在电极表面，过程简单，但稳定性差；包埋法：在温和的条件下形成聚合物的同时，将酶包埋在高聚物的微小格子中，或用物理方法将其包埋在凝胶中的方法；共价键合法：是酶蛋白分子上的官能团和固相支持物表面上的反应,酶的固定方法,4.酶传感器的分类 生物传感器按换能方式可分为电化学生物传感器和光化学生物传感器2种。下面来集中介绍一下电化学酶传感器和光化学酶传感器。,38,5.电化学酶传感器 基于电子媒介体的葡萄糖传感器，具有响应速度快、灵敏度高、稳定性好、寿命长、抗干扰性能好等优点，尤为受到重视。二茂铁由于有不溶于水、氧化还原可逆性好、电子传递速率高等优点，得到了广泛的研究和应用。目前研究的重点是防止二茂铁等电子媒介体的流失，从而提高生物传感器的稳定性和寿命。,6.光化学酶传感器7.酶传感器中应用的新技术纳米技术 固定化酶时引入纳米颗粒能够增加酶的催化活性,提高电极的响应电流值。孟宪伟等首次研究了二氧化硅和金或铂组成的复合纳米颗粒对葡萄糖生物传感器电流响应的影响,其效果明显优于这3种纳米颗粒单独使用时对葡萄糖生物传感器的增强作用,复合纳米颗粒可以显著增强传感器的电流响应。(2)基因重组技术 周亚凤等将黑曲霉GOD基因重组进大肠杆菌、酵母穿梭质粒,转化甲基营养酵母,构建出GOD的高产酵母工程菌株。重组酵母GOD比活力达426.63 u/mg蛋白,是商品黑曲霉GOD的1.6倍,催化效率更高。重组酵母GOD的高活力特性可有效提高葡萄糖传感器的线性检测范围。(3)提高传感器综合性能的其他技术 提高固定化酶活力的根本方法是保持酶的空间构象不发生改变。,9.3.2 微生物传感器,1.微生物的特征 微生物有三大特征：体积小，繁殖快，分布广。2.微生物传感器的类型 微生物传感器是以活的微生物作为敏感材料，利用其体内的各种酶系及代谢系统来测定和识别相应底物。它是由固定化微生物膜和电化学装置组成的。微生物传感器的种类很多，可以从不同的角度分类。根据微生物与底物作用原理的不同，微生物传感器可分为测定呼吸活性型微生物传感器和测定代谢物质型微生物传感器根据测量信号的不同，微生物传感器可分为电流型微生物传感器和电位型微生物传感器：换能器输出的是电位信号，电位值的大小与被测物的活度有关，二者呈能斯特响应。基于上述分类方法，常见的微生物传感器有电化学微生物传感器、燃料电池型微生物传感器、压电高频阻抗型微生物传感器、热敏电阻型微生物传感器、光微生物传感器等。,微生物传感器及其特性,3.电化学微生物传感器,4.压电高频阻抗型微生物传感器 压电高频阻抗型微生物传感器是基于高频压电晶体频率对溶液介质性质变化具有灵敏的响应特性制成的。微生物在生长过程中与外界溶液进行物质能量的交换，改变培养液的化学成分，使得培养液的阻抗发生变化，导致培养液的电导率和介电常数改变。5.燃料电池型微生物传感器 微生物传感器在发展初期，其应用一直被限定于间接的方式，即微生物作为生物催化剂起到一个敏感“元件”的作用，再与信号转换器相结合成为完整的微生物传感器。而燃料电池型微生物传感器能直接给出电信号。微生物在呼吸代谢过程中可产生电子，直接在阳极上放电，产生电信号。但是微生物在电极上放电的能力很弱，往往需要加入电子传递的媒介物介体，起到增大电流的作用。,微生物可作为燃料电池中的生物催化剂它在对有机物发生同化作用的同时，呼吸代谢作用增强并产生电子，通过介体放大电流作为介体的氧化-还原电对试剂可以把微生物的呼吸过程直接有效地同电极联系起来。,微生物燃料电池信号产生机理图,44,电化学氧化过程产生的流动电子，用电流或其他方法进行测量，在适当条件下此信号即成为检测底物的依据。基于这一原理，已研制出多种燃料电池型微生物传感器。燃料电池型微生物传感器是生物传感器新技术，这种新技术响应时间较短，其敏感机理是信号的传递，即电与微生物分解代谢的早期步骤相联系，这就避免在间接法中对分析物响应过程微生物要达到传代稳定状态的需要。,6.其他类型的微生物传感器,光微生物传感器：其原理是利用具有光合作用的微生物早光照作用下将待测物转变成电极敏感物质或者微生物本身释放氧的性质，将微生物固化后结合氧电极，氢电极实现对某种物质的测定。酶-微生物混合性传感器：为了使敏感膜的性能更加完善，可以使用由酶和微生物混合构成的敏感材料。利用细胞表层物质的传感器：此类传感器是根据细胞表层上的糖原、膜结合蛋白等物质对抗体、离子、糖等的选择性识别作用，将其与细胞的电极反应相结合，研制出新型的传感器，诸如变异反应传感器、识别革兰阴性菌和革兰阳性菌的传感器等。7.微生物传感器在环境中的应用实例在环境监测生物传感器中，一般将整个微生物细胞如细菌、酵母、真菌用做识别元件。这些微生物通常从活性泥状沉积物、河水、瓦砾和土壤中分离出术。利用微生物的新陈代谢机能发展的微生物传感器可进行污染物的检定和分析。,（1）BOD微生物传感器：该传感器有氧电极和微生物固定膜组成。当加入有机物时，固定化的微生物分解有机物，致使微生物呼吸作用增加，从而导致溶解氧减少，因而使氧电极电流响应下降，直到被测溶液向固化微生物膜扩散的氧量与微生物呼吸消耗的氧量之间达到平衡，使得到相应的稳定电流值（2）藻类污染的监测：一种名叫查顿埃勒的浮游生物是引起赤潮的重要物种，国外已研究出监测这种浮游生物的生物传感器。原理为检测这种生物或共代谢产物产生的化学发光。（3）硫化物微生物传感器：常用于硫化物的测定方法为分光光度法和碘量法，前者显色条件不易控制、操作烦琐；后者试剂消耗量大、成本高。微牛物传感用法是一种设备简单、操作简便、成本低的新方法。,47,9.3.3 免疫传感器,免疫传感器是将免疫测定技术与传感技术相结合的一类新型生物传感器。免疫传感器依赖于抗原和抗体之间特异性和亲和性，利用抗体检测抗原或利用抗原检出抗体。,抗体之间的特异性结合,2.免疫传感器的结构 免疫传感器在结构上与传统生物传感器一样，可分为生物敏感元件、换能器和信号数据处理器三部分。生物敏感元件是固定抗原或抗体的分子层；换能器是将识别分子膜上进行的生化反应转变成光、电信号；信号数据处理器则将电信号放大、处理、显示或记录下来。当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号、从而达到分析检测的目的。,免疫传感器结构图,49,3.免疫传感器的特点与传统仪器相比，免疫传感器具有如下的优点：抗原-抗体特异性结合决定了免疫传感器的高灵敏度，不受其他干扰，降低了检出下限；检测时间短，通常只需要几分钟或几十分钟；免疫传感器成本低，易于被检测部门和企业接受免疫传感器轻巧方便，可随身携带；操作简便，不需专业培训。,图中2、3两室间有固定化抗原膜，而1、3两室之间没有固定化抗原在1、2两室内注入0.9%的生理盐水，当在3室内倒入食盐水时，1、2室内电极间无电位差。若3室内注入含有抗体的盐水时，由于抗体和固定化抗原膜上的抗原相结合，使膜表面媳妇了特异的抗体，而抗体是具有电荷的蛋白质，从而使抗原固定化膜带电状态发生变化，因此1、2室内的电极间有电位差产生。,免疫传感器原理图,免疫传感器的基本原理是免疫反应，利用抗体能识别抗原并与抗原结合的功能而制成的生物传感器称为免疫传感器。它是利用固体化抗体（或抗原）膜与相应的抗原（或抗体）的特异反应，此反应的结果使生物敏感膜的电位发生变化。下图为这种免疫传感器的结构原理图。,免疫传感器的种类,把免疫传感器的敏感膜与酶免疫分析法结合起来进行超微量测量。它是利用酶为标识剂的化学放大。化学放大就是指微量酶（E）使少量基质（S）生成多量生成物（P）。当酶是被测物时，一个E应相对许多P，测量P对E来说就是化学放大，根据这种原理制成的传感器称为酶免疫传感器。右表中列出了目前的一些免疫传感器。,4.免疫传感器的分类 免疫传感器主要有：酶免疫传感器、电化学免疫传感器（电位型、电流型、电导型、电容型）、光学免疫传感器（标记型、非标记型）、压电晶体免疫传感器、表面等离子共振型免疫传感器和免疫芯片等。,53,光学免疫传感器 对一个生物系统的反应物或产物吸收或发出的电磁射线进行测定已在免疫传感器中流行起来，其中所用的是一批最大而且或许是最有前途的换能器，称为光学换能器。光学免疫传感器可分为间接式（有标记）和直接式（无标记）两种。前者一般是用酶或荧光作标记物来提供检测信号，但因为受检测的光水平较低，所以需要复杂的检测仪器。后者占了目前使用的光学免疫传感器中绝大部分，包括衰减式全内反射、椭圆率测量法、表面等离子体共振（SPR）、单模双电波导、光纤波导、干扰仪和光栅藕合器等多种形式。压电晶体免疫传感器 压电石英晶体免疫传感器是利用石英晶体对质量变化的敏感性，结合生物识别系统（抗原抗体特异性结合）而形成的一种自动化分析检测系统，具有灵敏度高、特异性好、响应快、小型简便等特点。,表面等离子体共振型免疫传感器如右图所示，该传感器包括一个镀有薄金属镀层的棱镜，其中金属层成为棱镜和绝缘体之间的界面。一束横向的磁化单向偏振光入射到棱镜的一个面上，被金属层反射，到达棱镜的另一面。反射光束的强度可以测量出来，用来计算入射光束的入射角的大小。反射光的强度在某一个特殊的入射角度sp 突然下降，就在这个角度，入射光的能量与由金属-绝缘体交接面激励产生的表面等离子共振（或“SPR”）相匹配。将一层薄膜（如生物膜）沉淀在金属层上，绝缘物质的折射系数会发生改变。折射系数依赖于绝缘物质和沉淀膜的厚度和密度的大小。测试陷波角的值，沉淀膜的厚度和密度就可以推导出来。,表面等离子体共振型免疫传感器,工作原理：免疫反应可分为特异性反应和非特异性反应两个阶段。特异性反应阶段，反应在数秒种内完成，但不出现可见反应现象。压电石英晶体免疫传感器将抗原或抗体固定于传感器电极表面形成敏感膜，利用抗原与抗体特异性结合后产生的微小质量变化，压电石英晶体免疫传感器的基本结构如图所示，主要由石英晶体、频率检测电路和数据处理系统等组成。,压电石英晶体免疫传感器结构示意图,56,电化学免疫传感器a电位测量式 这种免疫测试法的原理是先通过聚氯乙烯膜把抗体固定在金属电极上，然后用相应的抗原与之特异性结合，抗体膜中的离子迁移率随之发生变化，从而使电极上的膜电位也相应发生改变。膜电位的变化值与待测物浓度之间存在对数关系，因此根据电位变化值进行换算，即可求出待测物浓度。,b电流测量式电流测量式免疫传感器代表了生物传感中高度发达的领域，已有部分产品已商品化。它们测量的是恒定电压下通过电化学室的电流，待测物通过氧化还原反应在传感电极上产生的电流与电极表面的待测物浓度成正比。此类系统有高度的敏感性，以及与浓度线性相关性等优点（比电位测量式系统中的对数相关性更易换算），很适于免疫化学传感。,58,c导电率测量式 导电率测量法可大量用于化学系统中，因为许多化学反应都产生或消耗多种离子体，从而改变溶液的总导电率。通常是将一种酶固定在某种贵重金属电极上（如金、银、铜、镍、铬），在电场作用下测量待测物溶液中导电率的变化。例如，当尿被尿激酶催化生成离子产物NH4+时，后者引起溶液导电率增加，其增加值与尿浓度成正比。5.免疫传感器的实际应用（1）在微生物检测中的应用（2）在环境污染物、重金属检测中的应用,6.免疫传感器的发展趋势免疫传感器的发展主要呈现以下几个趋势：标记物的种类层出不穷，从酶、荧光发展成胶乳颗粒、胶体金、磁性颗粒和金属离子等；向微型化、商品化方向发展，廉价的一次性传感表面大有潜力可挖；酶免疫传感器、压电免疫传感器和光学免疫传感器发展最为迅速，尤其是光学免疫传感器品种繁多，目前已有几种达到了商品化。它们代表了免疫传感器向固态电子器件发展的趋势；与计算机等联用，向智能型、操作自动化方向发展；应用范围日渐扩大，已深入到环境监测、食品卫生等工业和临床诊断等领域，以后者尤为突出；继续提高其灵敏度、稳定性和再生性，使其更简便、快速和准确。随着分子生物学、材料学、微电子技术和光纤化学等高科技的迅速发展，免疫传感器会逐步由小规模制作转变为大规模批量生产，并在大气监测、地质勘探、通讯、军事、交通管理和汽车工业等方面 起着日益广泛的作用。,9.3.4 基因传感器,1.基因传感器的原理及分类所谓基因传感器，其原理就是通过固定在传感器或称换能器探头表面上的己知核昔酸序列的单链DNA分子（也称为ssDNA探针），和另一条互补的ssDNA分子，也称为目标DNA杂交，形成的双链DNA（dsDNA）会表现出一定的物理信号，最后由换能器反应出来。目前研究和开发的基因传感器从信息转换手段可区分为电极电化学式、压电式、石英晶体振荡器（QCM）质量式、场效应管式、光寻址式、表面等离子谐振（SPR）光学式DNA传感器等。,61,2.电化学基因传感器电化学式基因传感器是以电极为换能器，也就是将ssDNA控针固定在金电极、碳糊电极或玻璃电极等表面上，然后浸入含有目标ssDNA分子的溶液中，此时电极上的ssDNA控针与溶液中的互补序列的目标DNA单链分子杂交，原理如下图。,电化学基因传感器检测原理示意图,3.压电基因传感器 压电基因传感器是把声学、电子学和分子生物学结合在一起的新型基因传感器。它的基本原理如下图所示。换能器在压电介质中激发声波，以声波作为检测的手段。对压电传感器，其表面的质量增加和声波的频率降低 存在定量关系=-02/其中是和器件材料有关的常数，对不同的声波振动模式，k的具体表达式会有所不同。0是反应前传感器的频率，是反应区域的面积。负号表示质量的增加会引起频率的降低。压电基因传感器的检测方式可以分为主动式和被动式两种。,压电基因传感器示意图,4.质量式基因传感器质量式基因传感器是以石英晶体振荡器（QCM）为换能器，与电化学基因传感器一样，也是将单链的DNA探针固定在电极表面上，且固定的方法也与前者相同，然后浸入含有被测目标ssDNA分子的溶液中，当电极上的ssDNA探针与溶液中的互补序列的目标ssDNA分子杂交，QCM的振荡频率就会发生变化。5.场效应管基因传感器它是在场效应管的栅区固定一条含有十几到上千个核苷酸单链DNA片段当待测物分子与敏感栅作用时，发生电荷转移，使阈电压偏移，其改变量VT，可用ID保持恒定时的漏电压表示。该传感器的灵敏度可达ppb级，响应时间小于10s，便于多道测量，可微型化，实现在体测量。,64,6.光寻址基因传感器该传感器是电解质、绝缘层、半导体硅衬底三层结构，当在电解质溶液与半导体衬底之间放加直流偏置电压，用调制光束照射时，外部光电流与偏压及照射部位对应的光电流有关。7.SPR（Surface Plasma Resonance）基因传感器光学方法是最成熟和最好生物敏感技术，因为它有两个最重要的优点：非破坏性和高灵敏感度。8.基因传感器的应用实例（1）病毒感染类疾病的诊断（2）基因遗传病的诊断,微悬臂梁生物传感器是以微悬臂梁作为换能元件，在微悬臂梁的一面涂有生物敏感层，当被测物吸附到生物敏感层后，微悬臂梁表面应力或共振频率发生变化。通过检测微悬臂梁的弯曲变形或共振频移就可以测吸附到敏感层上的生物分子。,9.3.5 微悬臂梁生物传感器,66,微悬臂梁的结构形式 微悬臂梁具有多种结构形式，不同结构一般具有不同的用途。图9-14所示为几种微悬臂梁的常规形状，图（a）所示为矩形结构，这种结构加工方便，使用也最广泛；图（b）所示为T形结构，它是为了增加反射面积；图（c）所示U形结构增加微悬臂梁形变，一般用于加速度计；图（d）所示三角形结构微悬臂梁一般用于AFM，它的顶端有一个三角锥；音叉形微悬臂梁结构（图（e）主要用在角速度的检测上；图（f）所示桥式结构一般用于压力测量。,微悬臂梁的几种常规形状,2.微悬臂梁的工作模式 微悬臂梁具有两种基本工作模式，分别是弯曲模式和共振模式，它们也分别被称为静态模式和动态模式，如图所示。,微悬臂梁的两种工作模式,68,(1)弯曲模式静态模式 弯曲模式是指微悬臂梁在外界环境改变或力的作用下，其表面质量或表面应力发生变化，引起微悬臂梁的弯曲，通过检测微悬臂梁弯曲量的大小，就可以得出引起其弯曲的物理量或化学量。(2)共振模式动态模式 微悬臂梁的共振模式是通过检测微悬臂梁共振频率的变化得到引起其共振频率变化的物理量或化学量。3.微悬臂梁的激励与检测方法(1)微悬臂梁的激励方法 激励微悬臂梁振动或弯曲的方法主要有光热激励、声波激励、磁致激励和压电机械激励等四种。,光热激励是用光纤耦合激光束，垂直指向微悬臂梁的表面。在微悬臂梁的表面，激光束的能量被部分吸收。这样就可以建立一个时间/温度的函数关系，如果调制激光束的密度，就会驱动微悬臂梁周期性地弯曲。声波激励是用一个小型扬声器产生声波，声波通过空气传播到微悬臂梁后就会在微悬臂梁上造成压力差，迫使微悬臂梁振动。但是在液体环境中，液体的流动会造成声波共振，这就对微悬臂梁的检测产生一定影响。磁致激励是利用螺线管产生外部磁场，外部磁场直接激励微悬臂梁振动。压电激励是目前最常使用的激励微悬臂梁振动的方法，将压电叠堆固定在微悬臂梁固定端，当在压电叠堆上下电极之间施加交流电压时，压电叠堆由于逆压电效应，会产生相应的机械变形，从而带动微悬臂梁振动。,70,3.微悬臂梁形变的检测方法 外界环境的改变或者施加作用力会引起微悬臂梁的形变，要得到环境改变的情况或者作用力的大小，需要对该形变进行定量检测，一般来说，检测微悬臂梁的微小弯曲有以下几种方法：光反射法、激光干涉法、电容法、压阻法和压电法。,4.微悬臂梁传感器的应用实例 微悬臂梁最初是用于微小力的检测，主要是用在AFM上，近年来随着微悬臂梁传感技术的不断发展，它的测量对象越来越多，不仅能用于微小力检测，还能对温度、热能、磁场和质量等物理量进行测量，应用领域也扩大到生物检验、化学分析、环境监测、气味成分鉴定、DNA检测等场合，下面对微悬臂梁的应用做一些简单的介绍。使用微悬臂梁结构，可以探测多种不同物理量的变化。扫描力显微镜（AFM）和扫描探针显微镜（SPM）是微悬臂梁结构探测微小力最成功的应用，如图所示。微悬臂梁的使用使AFM能够检测到针尖和样品间纳米级的作用力。,微悬臂梁在AFM上的使用,72,5.微悬臂梁化学气敏传感器 微悬臂梁化学气敏传感器主要分为两种传感模式，一种是形变式，即通过敏感膜吸附分子引起表面应力变化；另一种是谐振式，即依靠粘附特定的细胞引起的质量变化而改变微悬臂梁的谐振频率。,6.微悬臂梁生物传感器 微悬臂梁生物传感器是以微悬臂梁作为换能元件，在微悬臂梁的一面涂有生物敏感层，当被测物质吸附到生物敏感层后，微悬臂梁的表面应力或共振频率发生变化。通过检测微悬臂梁的弯曲变形或共振频移就可以测吸附到敏感层上的生物分子。,74,7.基于微悬臂梁阵列的微传感器 单个微悬臂梁在使用时，只能对某一特定分析物的响应较明显，而在实际测量中，需要测量一个环境中多种分析物的质量，如果每次测量一种分析物，那么就要多次测量，每次测量前还要更换敏感层，同时与被测环境的多次接触会破坏环境本身，影响测量结果，对于这种复杂分析物的测量，采用悬臂梁阵列能达到很好的效果。同时，微悬臂梁阵列可以用其中一些梁作为参考，这些梁对分析物不起反应，将响应的微悬臂梁变化减去这些没有变化的梁，就可以排除背景信号和其他一些因素的干扰，实现差分测量。基于微悬臂梁阵列的生化传感器具有许多独特的优点：如灵敏度非常高、选择性多、可批量生产、价格低廉、操作简便、快速、动态响应得到改善、尺寸大大缩小、高精度、高可靠性、易制作成多元素的传感器阵列，可实现电子、机械系统集成的芯片等，并且不需要对样品进行预处理。,9.3.6 生物芯片技术,生物芯片技术的本质是生物信号的平行分析，它利用核酸分子杂交、蛋白亲和原理，通过荧光标记技术检测杂交或亲和与否，可迅速获得所需信息。1.生物芯片的种类 生物芯片可分为DNA芯片、蛋白质芯片以及芯片实验室三类。2.生物芯片的应用(1)DNA芯片的应用 DNA测序 基因诊断 基因表达的研究 毒理学研究 药物安全性研究,76,(2)蛋白质芯片的应用 蛋白质芯片能同时检测生物样品中与某种疾病或环境因子损伤可能相关的全部蛋白质含量变化情况.(3)芯片实验室的应用 芯片实验室可防止污染，使分析过程自动化，能大大提高分析速度和多样品分析能力，且设备体积小，便于携带，成为诊断感染性疾病最理想和最具潜力的一种生物芯片。,思考题,1.举例说明你所知道的生物传感器。2.生物传感器的特点有哪些，而其中哪几个又是最突出的特点。3.试结合文献阐述生物传感器的特点及其他方面的应用。4.请列举影响反应速度的各种因素。5.试说明温度变化时，反应速度都如何变化。6.阐述微生物反应与酶反应的异同点。7.简述抗原的理化性状。8.简述抗体的结构与特性。9.简述抗原-抗体反应的基本原理。10.试简述膜分离技术的工作原理，并分析各技术的适用场合。,78,11.试列举酶传感器的特点。12.举例说明酶的固定方法，并思考如何将各种方法联合使用。13.通过查找资料，试列举酶传感器的应用。14.微生物反应与酶反应的异同点。15.微生物的特征及微生物传感器的分类。16.常见的微生物传感器及其工作原理。17.阐述免疫传感器研究现状。18.试列举目前免疫传感器存在的主要缺陷。19.除了文中所提到的内容外，免疫传感器还将向哪方面发展以及有可能在哪方面得到广泛应用。,20.试说明免疫传感器的发展如何更好地形成商品化和产业化。21.关于基于免疫反应的传感器的研究与发展还可能产生哪些创新。22.试简述基因传感器的原理。23.结合几种基因传感器的工作特性，试分析其优缺点及发展方向。24.简述微悬臂梁生物传感器的工作原理。25.简述微悬臂梁的几种结构形式，以及不同结构具有的不同用途。26.简述微悬臂梁传感器的多种应用。27.试举例说明生物芯片在医学上的应用。,80,参考资料,（插 图）,8