仪器分析第6讲色谱法引论.ppt
2023/6/14,第六讲 色谱法引论,第一节 色谱法概述,generalization of chromatograph analysis,2023/6/14,一、色谱法的特点、分类和作用,1.概述 分离、分析混合物最有效的方法。俄国植物学家茨维特在1901年使用的装置：色谱原型装置，如图。,色谱法首先是一种分离技术，同时也是一种分析技术。试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在色谱分离柱中两相间不断进行着的分配过程 其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。,2023/6/14,当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。,与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础,2023/6/14,2.色谱法分类,(1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱,2023/6/14,(2)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。,2023/6/14,(3)其他色谱方法,薄层色谱和纸色谱：比较简单的色谱方法,凝胶色谱法：测聚合物分子量分布。超临界色谱:CO2流动相。高效毛细管电泳:九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器。,2023/6/14,3.色谱法的特点,（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处：被分离组分的定性较为困难。,2023/6/14,气固色谱的固定相:多孔性的固体吸附剂颗粒。固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。气液色谱的固定相:由 担体和固定液所组成。固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。气固色谱的分离机理:吸附与脱附的不断重复过程；气液色谱的分离机理：气液两相间的反复多次分配过程。,二、色谱分离过程,色谱分离过程是在色谱柱内完成的。以气相色谱为例，气固色谱和气液色谱，两者的分离机理不同。,2023/6/14,1.气相色谱分离过程,当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。,2023/6/14,2.分配系数（partion factor）K,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。,分配系数是色谱分离的依据。,在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：,2023/6/14,分配系数 K 的讨论,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。,2023/6/14,3.分配比（partion radio）k,在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：,1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。3.分配比可以由实验测得。,分配比也称：容量因子(capacity factor)；容量比(capacity factor)；,2023/6/14,4.分配系数与分配比的关系,式中为相比率，Vm/VS。Vm为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；VS为固定相体积。是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。填充柱：635；毛细管柱：501500。,K=k.,2023/6/14,5.分配比k与保留时间的关系,分配比k可直接从色谱图测得。若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分别为tr和t0，则：,2023/6/14,三、色谱流出曲线与术语,1.基线 无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2.保留值,（1）时间表示的保留值 保留时间（tr）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；,死时间（tM或t0）：不与固定相作用的物质（如空气）的保留时间；调整保留时间（tr）：tr=trt0,2023/6/14,（2）用体积表示的保留值,保留体积（VR）：Vr=trF0F0为柱出口处的载气流速，单位：m L/min。死体积（V0）：V0=t0 F0 调整保留体积(VR)：V r=Vr V0,2023/6/14,3.相对保留值r21（选择因子）,组分2与组分1调整保留值之比：r21=tr2/tr1=Vr2/Vr1,相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性，又称选择因子，广泛用作色谱定性的依据！,2023/6/14,4.分配系数 K 及分配比 k 与选择因子的关系,对A、B两组分的选择因子，用下式表示：=t r(B)/t r(A)=k(B)/k(A)=K(B)/K(A)通过选择因子把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。,2023/6/14,5.区域宽度,用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2或W1/2)：色谱峰高一半处的宽度W1/2=2.354（3）峰底宽(Wb)：Wb=4,2023/6/14,6.色谱流出曲线的数学描述,色谱峰为正态分布时，色谱流出曲线上的浓度与时间的关系为：,2023/6/14,第二节 色谱理论基础,一、塔板理论plate theory二、速率理论rate theory三、分离度resolution,Fundamental of chromatograph theory,2023/6/14,色谱理论,色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。,组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论；,2023/6/14,一、塔板理论-柱分离效能指标,1.塔板理论（plate theory）半经验理论；将色谱分离过程比拟作精馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于精馏塔塔板上的平衡过程）。,2023/6/14,塔板理论的假设 1.在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。2.以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。3.所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4.分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。,2023/6/14,色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H色谱柱的理论塔板数：n 则三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系（重要公式）：,2023/6/14,2.有效塔板数和有效塔板高度,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在t0时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：,（重要公式）,2023/6/14,3.塔板理论的特点和不足,(1)当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。,(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,2023/6/14,3.塔板理论的特点和不足,(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。,(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,2023/6/14,二、速率理论-影响柱效的因素,1.速率方程（也称范.弟姆特方程式）H=A+B/u+Cu H：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s),减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；A、B、C三项各与哪些因素有关？,2023/6/14,A涡流扩散项,A=2dp dp：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒直径dp，填充的越均匀，则A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。,2023/6/14,B/u 分子扩散项,B=2 Dg：弯曲因子，反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散;(4)扩散系数：Dg(M载气)-1/2；M载气，B值。,2023/6/14,k为容量因子；Dg、DL为扩散系数。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。,C u 传质阻力项,对GC，传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即：C=（Cg+CL）,2023/6/14,2.载气流速与柱效最佳流速,载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效。,H-u曲线与最佳流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。,2023/6/14,3.速率理论的要点,(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。,(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。,2023/6/14,3.速率理论的要点,(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。,(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,2023/6/14,三、分离度（分辨率）,塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差色谱过程的热力学因素；区域宽度色谱过程的动力学因素。色谱分离中的四种情况如图所示：,2023/6/14,讨论：,色谱分离中的四种情况的讨论：,柱效较高，K(分配系数)较大,完全分离；K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；柱效较低，K较大,但分离的不好；K小，柱效低，分离效果更差。,2023/6/14,分离度的表达式：,R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%，相邻两峰完全分离的标准,2023/6/14,R的定义并未反映影响分离度的诸因素。实际上，R受柱效n、相对保留值r21（选择因子a）和容量因子k三个参数的控制，它们之间的关系可以用基本色谱分离方程式来表示。,四、基本色谱分离方程式,2023/6/14,推导可得基本色谱分离方程式：,2023/6/14,式中，a为选择性因子，a=r21,或：,2023/6/14,在实际应用中，往往用neff 代替n，可得基本色谱分离方程式的又一表达式：,或：,2023/6/14,或,上式更加常用！,2023/6/14,1、分离度与柱效的关系 当固定相确定，被分离物质对的确定后，分离度将取决于n。这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比，即(R1/R2)2=n1/n2=L1/L2 说明用长的色谱柱可以提高分离度，但延长了分析时间。因此，提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。,2023/6/14,2.分离度与选择因子的关系,由基本色谱方程式判断，当=1时，R=0。这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然，大，选择性好。一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有效增大值。,2023/6/14,2.分离度与选择因子的关系,增大是提高分离度的最有效方法。研究证明的微小变化，就能引起分离度的显著变化。计算可知，在相同分离度下，当增加一倍，需要的n有效减小10000倍。增大的最有效方法是选择合适的固定液。,2023/6/14,在实际中，基本色谱分离方程式是很有用的公式，它将柱效、选择因子、分离度三者的关系联系起来了，知道其中两个指标，就可以计算出第三个指标。,五、基本色谱分离方程式的应用,2023/6/14,例题1：,有一根1m长的柱子，分离组分1和2，得到如下图所示的色谱图。图中，横坐标l为记录笔走纸距离，若欲得到R=1.2的分离度，有效塔板数应为多少？色谱柱要加到多长？,2023/6/14,解：先求出组分2对组分1的相对保留值r2,1，即值：,由式（15.39），求分离度R：,2023/6/14,由式（15.27），求有效塔板数neff：,若使R=1.2，所需塔板数可由式（15.43）计算，即：,因此，欲使分离度R达到1.2，需有效塔板数为2788块，则所需柱长为：,2023/6/14,例题2：,在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1 cm，柱长是多少？解：r21=100/85=1.18 n有效=16R2/(-1)2=161.52(1.18/0.18)2=1547（块）L有效=n有效H有效=15470.1=155 cm 即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。,2023/6/14,例题3：,在一定条件下，柱长1m，柱效n3600，两个组分的保留时间分别为12.2s和12.8s，计算分离度。要达到完全分离，即R=1.5，计算需要的柱长。解：据P308（15.26式），有,分离度：,2023/6/14,P316：上交的作业：习题 5；6；7；17不上交的作业：习题 14；11；13；18；19,
