【SN商检标准】snt 1135.5 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法.doc

中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准犛 犖 犜 马 铃 薯 环 腐 病 菌 检 疫 鉴 定 方 法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀 狅犳 犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉 犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊 狊狌犫狊狆 狊犲狆犲犱狅狀犻犮狌狊 发 布 实 施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖 犜 前 言 共分为五个部分马铃薯癌肿病检疫鉴定方法：；马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法；马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法；马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法。本部分是 的第 部分。本部分的附录 、附录 均为规范性附录，附录 为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本部分主要起草人：赵文军、陈红运、梁新苗、张乐、朱水芳、魏梅生。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖 犜 马 铃 薯 环 腐 病 菌 检 疫 鉴 定 方 法 范 围 的 本 部 分 规 定 了 马 铃 薯 环 腐 病 菌 的 检 疫 鉴 定 方 法 。本 部 分 适 用 于 所 有 进 出 境 马 铃 薯 种 薯 及 商 品 用 薯 的 检 疫 和 鉴 定 。 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 的 本 部 分 。双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定在 固 相 支 持 物 上 （酶 联 板 ）包 被 细 菌 特 异 性 抗 体 ，加 入 待 测 样 品 后 ，再 用 酶 标 记 的 细 菌 抗 体 进 行 免 疫识 别 ，最 后 通 过 酶 促 化 学 反 应 检 测 细 菌 是 否 存 在 的 一 种 血 清 学 检 测 方 法 。 犘 犆 犚以 耐 热 聚 合 酶 和 一 对 引 物 （与 待 测 目 标 核 酸 分 子 序 列 同 源 的 片 段 ）通 过 高 温 （ 分 子 变 性 ）和 低 温 （引 物 和 目 标 核 酸 分 子 复 性 并 被 耐 热 聚 合 酶 延 伸 ）交 替 循 环 扩 增 待 测 目 标 核 酸 分 子 的 方 法 。 原 理马 铃 薯 环 腐 病 菌 （犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉 犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊 狊犲狆犲犱狅狀犻犮狌狊 ），属 厚 壁 菌 门 （ ）厚 壁 细 菌 纲（ ）棒 形 杆 菌 属 （犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉 ），依 靠 病 薯 进 行 远 距 离 传 播 。 寄 主 及 世 界 分 布 参 见 附 录 。 仪 器 和 用 具 仪 器 设 备 仪 、超 净 工 作 台 、灭 菌 锅 、制 冰 机 、核 酸 蛋 白 分 析 仪 、高 速 冷 冻 离 心 机 、台 式 小 型 离 心 机 、超 低 温冰 箱 、常 规 冰 箱 、旋 涡 振 荡 器 、微 量 进 样 器 、电 泳 仪 、凝 胶 成 像 系 统 、酶 标 仪 。 主 要 试 剂除 另 有 规 定 外 ， 所 有 试 剂 均 为 分 析 纯 。 缓 冲 液 、 氯 化 镁 （ ）、 （ 、 、 、 ）、犜 犪狇 聚 合 酶 、引 物 和 探 针 、牛 肉 汁 、酵 母 膏 、磷 酸 氢 二 钾 （ ）、磷 酸 二 氢 钾（ ）、硫 酸 镁 （ ）、葡 萄 糖 、琼 脂 ，酶 联 检 测 试 剂 见 附 录 。 病 菌 的 鉴 定 症 状 检 查取 样 品 量 （若 样 品 少 可 适 量 增 大 比 例 ）的 块 茎 进 行 检 查 。 将 块 茎 横 切 ，检 查 环 腐 病 菌 侵 染症 状 ，挤 压 块 茎 ，检 查 维 管 组 织 是 否 浸 解 。 发 病 轻 者 维 管 束 变 黄 ，呈 不 连 续 的 点 状 变 色 ；重 者 整 个 维 管 束环 变 色 。 病 菌 也 可 侵 害 块 茎 维 管 束 周 围 的 薄 壁 组 织 ，呈 环 状 腐 烂 ，严 重 时 可 引 起 皮 层 与 髓 部 组 织 分 离 ，轻 轻 挤 压 块 茎 从 维 管 束 中 涌 出 奶 酪 样 的 柱 状 物 。 块 茎 表 面 的 症 状 在 轻 度 危 害 时 不 明 显 ，随 病 害 发 展 ，皮 色 变 暗 或 变 褐 ，严 重 时 表 皮 可 出 现 裂 缝 。 双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定利 用 双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 法 对 样 品 进 行 初 筛 （见 附 录 ），若 检 测 结 果 为 阳 性 ，需 进 行 病 原犛犖 犜 菌的分离培养及 病原菌的分离培养 培养基的制备方法测定。营养肉汤酵母膏培养基（）： 牛肉汁 ，酵母膏 ，磷酸氢二钾（ ） ，磷酸二氢钾（ ）（ ）溶液。 ，葡萄糖 ，琼脂 ，水 ，灭菌后加过滤灭菌的 硫酸镁 块茎中病原菌的分离培养马铃薯块茎洗净后用乙醇表面消毒，从带病薯块的维管束挑取少量菌脓在培养基上划线或从带病块茎的维管束圈切取少量病组织，在灭菌水中捣碎制成悬浮液，用接菌环蘸菌悬液划 线 ，经两次纯化培养后转入培养基斜面。 犘犆犚凝胶电泳检测见附录 。 结果判定若酶联免疫检测结果为阳性，可初步判定为检出马铃薯环腐病菌，需利用方法进一步检测。在 环腐病菌。检测中，若 凝胶电泳检测结果为阳性，而且扩增片段大小与描述相符可判定为马铃薯 样品保存与复核 样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。 对检出马铃薯环腐病菌的样品应保存于冰箱中，以备复核。 该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为马铃薯环腐病菌的菌株，应妥善保存。 将菌株接种于培养基斜面上，培养，然后冰箱保存，或液体培养至对数生长期，加入灭菌甘油并混匀，长期保存或用安瓿管冷冻干燥长期保存。 对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。 结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。 若酶联免疫方法需有酶联反应的原始数据，凝胶电泳检测需有电泳结果照片。 复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责，主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。犛 犖 犜 附 录 犃（资 料 性 附 录 ）寄 主 及 世 界 分 布犃 寄 主 范 围自 然 寄 主 只 有 马 铃 薯 （犛狅犾犪狀狌 犿 狋狌犫犲狉狅狊狌 犿 ）， 接 种 寄 主 有 番 茄 （犔 狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀 犲狊犮狌犾犲狀狋狌 犿 ）、 茄 子（犛狅犾犪狀狌 犿 犿 犲犾狅狀犵犲狉犪 ）等 。犃 分 布 地 区阿 富 汗 、日 本 、柬 埔 寨 、朝 鲜 、黎 巴 嫩 、尼 泊 尔 、土 耳 其 、中 国 、中 国 台 湾 、巴 基 斯 坦 、越 南 、俄 罗 斯 、 捷 克 、斯 洛 伐 克 、丹 麦 、芬 兰 、挪 威 、波 兰 、瑞 典 、加 拿 大 、美 国 、哥 斯 达 黎 加 、巴 拿 马 、秘 鲁 、委 内 瑞 拉 、德 国 、 希 腊 、前 南 斯 拉 夫 、葡 萄 牙 、奥 地 利 、哥 伦 比 亚 、法 国 、墨 西 哥 、罗 马 尼 亚 、比 利 时 。附 录 犅（规 范 性 附 录 ）双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定犅 试 材犅 酶 联 板 的 要 求使 用 质 量 有 保 证 厂 商 生 产 的 酶 联 板 。犅 包 被 抗 体特 异 性 的 马 铃 薯 环 腐 病 菌 抗 体 。犅 酶 标 抗 体碱 性 磷 酸 酯 酶 标 记 的 马 铃 薯 环 腐 病 菌 抗 体 。犅 底 物 溶 液对 硝 基 苯 磷 酸 二 钠 （ ） 溶 解 于 底 物 缓 冲 液 中 ，现 配 现 用 。犅 样 品 抽 提 缓 冲 液溶 于 × ：亚 硫 酸 钠 （ ） （ ） 叠 氮 化 钠 （ ） 吐 温 （ ） 调 值 至 ， 冰 箱 保 存 。犅 包 被 缓 冲 液碳 酸 钠 （ ） 碳 酸 氢 钠 （ ） 叠 氮 化 钠 （ ） 溶 于 蒸 馏 水 ，调 值 至 ，蒸 馏 水 定 容 至 ， 冰 箱 保 存 。犅 犘 犅犛犜 缓 冲 液 （洗 涤 缓 冲 液 ）溶 于 蒸 馏 水犛犖 犜 氯化钠（）磷酸氢二钠（ ）磷酸二氢钾（ ） 氯化钾（）吐温 （）调 值至犅 酶标抗体稀释缓冲液，冰箱保存。溶于 ×：（牛血清白蛋白）或脱脂奶粉 （ ） 叠氮化钠（ ）调 值至，冰箱保存。犅 底物（ 犖犘犘）缓冲液溶于 蒸馏水：氯化镁（ ） 叠氮化钠（ ） 二乙醇胺 用 值调至，蒸馏水定容至 ，冰箱保存。犅 程序犅 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板孔中， 孔 ，加盖，孵育 ，清 空 孔 中 溶液 ，洗涤 次 ，每次。犅 样品制备待测样品按（重量 体积，犠 犞 ）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，犵 离心 ，上清液即为制备好的检测样品。 对于块茎可以在加有适量抽提缓冲液的厚塑料袋中拍碎，取上清液。 对阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。犅 加样加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照， 孔 ，加盖，孵育或 冰箱孵育过夜，洗涤 次 ，每次犅 加酶标抗体。 每个样品重复 次 。根据说明书用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度，加入到酶联板中， 孔 ，加盖 ，孵育 ，洗涤 次 ，每次。犅 加底物将底物 加入到底物缓冲液中，终浓度为 （现配现用）， 按每孔加入 ，室温避光孵育。犅 读数后用酶标仪在处读犗犇值 。犅 结果判断犅 对照孔的犗犇 值 （缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔）， 应该在质量控制范围内，即 ：缓冲液孔和阴性对照孔的犗犇 值均小于，当阴性对照孔的犗犇 值小于时 ，按计犛 犖 犜 算 ；阳 性 对 照 犗 犇 值 阴 性 对 照 犗 犇 值 大 于 ；重 复 性 好 。犅 在 满 足 了 质 量 要 求 后 ，结 果 作 如 下 判 断 ：样 品 犗 犇 值 阴 性 对 照 犗 犇 值 明 显 大 于 ，判 为 阳 性 ；样 品 犗 犇 值 阴 性 对 照 犗 犇 值 在 阈 值 附 近 ，判 为 可 疑 样 品 ，需 重 新 做 一 次 ，或 用 其 他 方 法 加 以验 证 ；样 品 犗 犇 值 阴 性 对 照 犗 犇 值 明 显 小 于 ，判 为 阴 性 。若 采 用 商 品 化 试 剂 盒 ，按 照 试 剂 盒 说 明 操 作 并 判 定 结 果 。附 录 犆（规 范 性 附 录 ）犘 犆 犚 凝 胶 电 泳 检 测犆 病 原 细 菌 犇 犖 犃 的 提 取犆 将 供 试 菌 株 在 斜 面 培 养 基 上 培 养 。犆 每 一 试 管 中 加 入 磷 酸 钠 缓 冲 液 洗 下 菌 苔 。犆 将 细 菌 悬 浮 液 转 移 至 一 干 净 的 离 心 管 中 ， 犵 离 心 ，弃 上 清 液 ，加 入 缓冲 液 、 溶 液 ， 蛋 白 酶 ，混 匀 ， 水 浴 孵 育 。犆 加 入 等 体 积 的 三 氯 甲 烷 异 戊 醇 （ ）混 匀 ， 犵 离 心 ，取 上 清 液 。犆 加 入 等 体 积 三 氯 甲 烷 异 戊 醇 （ ）混 匀 ， 犵 离 心 。犆 将 上 清 液 移 至 一 新 管 ，加 入 倍 体 积 的 异 丙 醇 ，混 匀 ， 犵 离 心 ，弃 上 清 液 ； 乙醇 洗 涤 沉 淀 ，室 温 干 燥 后 ，将 溶 解 在 灭 菌 双 蒸 水 中 。注 ：病 原 菌 提 取 也 可 省 略 ，可 直 接 用 培 养 的 菌 株 稀 释 悬 浊 液 作 为 模 板 进 行 反 应 。犆 引 物 序 列正 向 引 物 ： ，反 向 引 物 ： 犆 犘 犆 犚 反 应 体 系 及 参 数犆 犘 犆 犚 反 应 体 系见 表 。表 犆 犘 犆 犚 反 应 体 系试 剂 名 称终 浓 度 × 反 应 缓 冲 液 ×氯 化 镁 （ ） 正 向 引 物 反 向 引 物 犜 犪狇 聚 合 酶 模 板 补 至 犛犖 犜 犆 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以待测健康的马铃薯叶片为模板；阳性对照：采用马铃薯环腐病菌或含有待测基因序列的质粒；空白对照：设两个，一是提取时设置的提取空白对照（以 代替样品）， 二是反 应的空白对照（以水代替模板 ）。犆 犘犆犚的反应参数：；，个循环。注 ：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。犆 琼脂糖凝胶电泳制备的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和扩增产物，用 作为分子量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性条带，并拍摄记录。犆 结果判断通过观察，若有 大小的产物带出现，可判定为阳性。犛 犖 犜 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫行 业 标 准马 铃 薯 环 腐 病 菌 检 疫 鉴 定 方 法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北 京 复 兴 门 外 三 里 河 北 街 号邮 政 编 码 ： 网 址 电 话 ： 中 国 标 准 出 版 社 秦 皇 岛 印 刷 厂 印 刷开 本 × 印 张 字 数 千 字 年 月 第 一 版 年 月 第 一 次 印 刷印 数 书 号 ： · 定 价 元