芙蓉葵Hibiscus moscheutos L有丝分裂核型分析.doc

芙蓉葵（Hibiscus moscheutos L.）有丝分裂核型分析及减数分裂观察1刘坤，王省芬，张桂寅，迟吉娜，马峙英*河北农业大学，河北保定 (071001)E-mail: mzhy摘要：芙蓉葵是棉属的近缘植物，具有棉花需要的早熟性、结实性、抗寒性、抗黄萎病性等优良性状。本文对芙蓉葵的细胞学特征进行了研究，为其优良性状在棉花遗传改良中的应 用提供细胞遗传学资料和理论依据。利用压片法获得了分散良好、形态清晰的有丝分裂中期染色体，核型分析结果表明：芙蓉葵染色体的平均长度为5.96±0.83µm，在1号染色体上发现随体；臂比>2的染色体占10.5%，最长染色体与最短染色体的比值为1.68，核型类型为2A型， 核型公式为2n=2x=38=32m+6sm(2SAT)。芙蓉葵花粉母细胞的减数分裂正常，中期有19个二价体（19），为典型的二倍体物种。 关键词：芙蓉葵；染色体；有丝分裂；核型；减数分裂中图分类号：S682.1+91. 引言芙蓉葵(Hibiscus moscheutos L.)为锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus)多年生直立草本植 物，是棉属的近缘植物，原产北美洲，多生长于海边、湖边、江口等地带。我国由美国东南 部引入1，在全国各个城市都有绿化种植。本课题组经过十多年的种植，发现芙蓉葵有利用 价值的一些特性：早熟性、结实性、抗寒性和抗黄萎病性，而这些特性正是栽培棉花所需要 的，对棉花的遗传改良具有实际意义。前人对芙蓉葵的研究主要集中在基本形态特征、一般 的生物学特性、分布及生长环境等方面2-10，发现芙蓉葵幼苗的根具有抗铝性11。木槿属植 物种类繁多，种间关系复杂，染色体数目变化范围大，倍性关系复杂12-15。对于芙蓉葵的细 胞学研究，Longley 曾报道芙蓉葵(Hibiscus moscheutos L.= Hibiscus palustris L.) n=192016， 而关于其染色体形态、核型分析、倍性、减数分裂等至今尚未见报道。本研究以芙蓉葵为材料，利用根尖压片法确定其体细胞染色体数目，通过研究核型分析 和花粉母细胞减数分裂过程中染色体的形态与行为特征，进一步确定芙蓉葵的倍性，为芙蓉 葵与棉花的体细胞杂交和芙蓉葵染色体加倍等细胞工程研究提供依据，为将其有利基因导入 棉花，进一步利用芙蓉葵优异基因提供参考资料。2. 材料和方法2.1 试验材料本研究所用芙蓉葵(Hibiscus moscheutos L.)材料的种子由河北农业大学棉花遗传育种研 究室提供。花蕾取自河北农业大学棉花育种试验田多年生芙蓉葵植株。2.2 试验方法2.2.1 根尖细胞染色体制片和观察 将芙蓉葵种子浸泡至种皮开裂，3234恒温箱催芽。待胚根长至 0.7cm 左右时取材，用 0.002M 8-羟基奎啉于室温下预处理 2.5h，卡诺(Canoys)固定液固定 224h，将根冲洗 571 本课题得到河北省自然科学基金基地重点项目（批准号：C2006001034）的资助。- 5 -次后转移到 75%酒精中保存备用。取根尖分生组织 12mm，在 2%纤维素酶和 2%果胶酶(1:1)混合液中 37酶解 2.5h，用蒸馏水冲洗 57 次，固定 34h，再充分冲洗采用改良的卡宝品 红染色，压片镜检，观察统计染色体数目，并摄影。2.2.2 根尖细胞染色体核型分析核型分析采用李懋学、陈瑞阳(1985)17和 Levan(1964)18等的植物核型分析标准，核型 分类按 Stebbins(1971)19的分类标准进行。挑选 5 个分散良好、着丝点清晰的染色体中期细 胞测量其长臂、短臂值，求其平均数，随体不计算在总长度内，制成染色体参数表。根据所 得数据编号并进行同源染色的人工配对，选择具有代表性的分裂相排成核型，用 EXCEL 绘 制核型模式图20。2.2.3 花粉母细胞减数分裂的观察方法 采用花药涂片法观察花粉母细胞的减数分裂。具体是：在芙蓉葵开花盛期，早晨 8：009：00 取花蕾(4mm×6mm)，然后除去芙蓉葵的苞叶及花萼与花瓣，露出雄蕊，在卡诺(Canoys)固定液中固定 24h 后，转入 70%的酒精 4保存备用。取雄蕊一两枚，加 12 滴改良的卡宝 品红染色液，用镊子挤出花粉母细胞，捣碎、涂片，加盖玻片。显微镜观察并摄影。3. 结果与分析3.1 芙蓉葵根尖染色体数目的确定本研究利用 30 个根尖，统计了 300 个可准确计数染色体的根尖有丝分裂中期细胞，染 色体数目为 38 的细胞为 276 个，占观察细胞的 92%；24 个细胞的染色体数目为 37、36、35、34、33、32、29 等，占观察细胞的 8%。因此，确定芙蓉葵体细胞染色体数目为 38， 即 2n=38。3.2 芙蓉葵根尖细胞染色体的核型分析选择染色体缢痕清晰且分散良好的 5 个根尖细胞进行核型分析。结果表明，芙蓉葵染色 体的平均长度为 5.96±0.83µm，长度范围 4.427.23µm，染色体具有一对随体，分为近中着 丝粒(sm)和中着丝粒(m)两种类型，核型公式为 2n=2x=38=32m+6sm(2SAT)。在其体细胞的19 对染色体中，第 1、4、12 对为近中着丝粒染色体(sm)，其中第 1 对染色体具有随体，其 他 16 对为中着丝粒染色体(m)。臂比值大于 2 的染色体占染色体总数的 10.5%，最长染色体 与最短染色体比值为 1.68(<2:1)，根据 Stebbins(1971)的核型分类标准，芙蓉葵的核型类型为2A 型，属于较对称型。选取其中一个中期分裂相进行同源染色体人工配对分析，芙蓉葵染 色体核型分析参数表、核型图和核型模式图如表 1、图 1 和图 2 所示。表 1 芙蓉葵核型分析参数表Table 1 Parameters obtained in karyotype analysis in Hibiscus moscheutos染色体序号平均长度(µm)相对长度(%)臂比(长/短)类型ChromosomeNo.Average length(S+L=T)Relative length(S+L=T)Arm ratio(L/S)Type12.205.037.23±0.981.944.496.43±0.342.31sm*23.00（1.37）4.227.22±1.052.65（1.22）3.786.43±0.371.43m32.544.276.81±0.722.273.816.08±0.371.68m42.144.606.74±0.751.924.096.01±0.232.13sm52.454.066.51±0.742.193.605.79±0.071.65m62.163.346.50±0.652.553.095.64±0.051.21m72.853.476.33±0.632.153.425.57±0.071.59m82.403.846.24±0.622.313.215.52±0.051.39m92.573.616.16±0.612.073.415.48±0.061.65m102.333.826.15±0.682.083.255.33±0.111.56m112.323.665.98±0.622.163.045.20±0.161.40m122.433.405.83±0.661.823.215.03±0.091.77sm132.033.615.64±0.642.102.894.99±0.081.38m142.363.245.60±0.591.912.994.90±0.041.56m152.193.145.33±0.471.972.804.77±0.111.42m161.993.105.09±0.571.772.764.53±0.161.56m172.062.754.81±0.721.842.454.29±0.231.33m182.012.554.56±0.481.792.284.07±0.111.27m191.782.644.42±0.471.592.363.95±0.131.48m注：*表示有随体，且随体长度未计算在内Note：*showed the satellites, and the length of satellites was not included in the chromosome length图 1 芙蓉葵的根尖细胞染色体和核型Fig. 1 Chromosomes and karyotype of root tip cells of Hibiscus moscheutos相对长度染色体序号图 2 芙蓉葵核型模式图Fig. 2 Idiogram of Hibiscus moscheutos3.3 芙蓉葵花粉母细胞减数分裂过程观察本研究详细观察了芙蓉葵花粉母细胞减数分裂过程中染色体的行为特点和配对情况。结 果表明：芙蓉葵的减数分裂在同一朵花中中部小花的同步性较高，有终变期、中期、后期 三个时期。在终变期观察到了 19 个二价体，即 19 (图 3)，此外还观察到 38 个单价体(图4)；在中期，19 个二价体分散排列在赤道板近旁，纺锤丝与着丝点连接(图 5)；到后期，19 个二价体同步向两极分离，没有染色体滞后的异常现象(图 6)。说明芙蓉葵为典型的二倍 体，基数 x=19。图 3 终变期，示 19 个二价体图 4 终变期，示 38 个单价体Fig. 3 Diakinesis, showing 19 bivalentsFig. 4 Diakinesis, showing 38 univalents图 5 中期，二价体分布在赤道板近旁图 6 后期，二价体向两极分Fig. 5 Metaphase, bivalents distributed nearFig. 6 Anaphase, bivalents separated two the equatorial plate polars4. 讨论芙蓉葵是木槿属一个特殊的种，既有无性繁殖，又有有性繁殖。本文对芙蓉葵的细胞学 特征进行了详细研究，获得了分散良好、形态清晰的有丝分裂中期染色体。核型分析表明： 芙蓉葵染色体的平均长度为 5.96±0.83µm，1 号染色体有随体；臂比>2 的染色体占 10.5%， 最长染色体与最短染色体的比值为 1.68 ，核型类 型为 2A 型，核型公式 为2n=2x=38=32m+6sm(2SAT)。芙蓉葵花粉母细胞减数分裂中，染色体配对和分散行为正常， 中期有 19 个二价体，后期所有二价体向两极分离并无落后染色体。研究结果填补了国内外关于芙蓉葵体细胞染色体形态、有丝分裂核型、减数分裂行为及倍性的空白。 在芙蓉葵体细胞染色体制片技术中，根尖的取材很关键。本研究在胚根伸长至 0.7cm 时取材，此时的根尖细胞分裂指数高、细胞质稀薄，易于染色和制片。用 0.002 M 8-羟基奎啉 预处理根尖 2.5h 是制片技术最为关键的步骤，预处理后染色体适度浓缩和变值，染色体分散良好。用纤维素酶和果胶酶的混合液酶解 2.5h,可以获得平整而清晰的照片。本研究观察到芙蓉葵染色体数目 2n=38，这与 Longley 报道芙蓉葵(Hibiscus moscheutos L.= Hibiscus palustris L.) n=192016相似，没有发现非整倍体变异和多倍体现象。本研究发现，少数体细 胞染色体数目不符合 38，其原因可能是压片时丢失了一条或数条染色体，另外芙蓉葵是多 年生草本植物，由于本身的无性繁殖，可能会出现一定的自然变异。参考文献1吴征益，路安民，汤彦承，等中国被子植物科属综论M科学出版社，2003，5502陈汉斌，郑亦津，李法曾，主编山东植物志M青岛出版社，1997，677-6783河北植物志第二卷M河北科学技术出版社，1988，1374中国植物志，第四十九卷，第二分册M科学出版社，1984，81-835Kudoh H, Wigham D F. Microgeographic genetic structure and gene flow in Hibiscus moscheutos(Malvaceae) populations J. American Journal of Botany, 1997, 84(9): 1285-1293.6Kudoh H, Whigham D F. A genetic analysis of hydrologically dispersed seeds of Hibiscus moscheutos(Malvaceae) J. American Journal of Botany, 2001, 88(4): 588-593.7Liu Hong, Timothy P S. Influence of seed age and inbreeding on germination and seedling growth inHibiscus moscheutos (Malvaceae) J. Journal of the Torrey Botanical Society, 2001, 128(1): 16-24.8Allison A S, Timothy P S. Individual variation in the vigor of self pollen and selfed progeny in Hibiscus moscheutos (Malvaceae) J. American Journal of Botany, 1993, 80(2): 160-164.9Allison A S, Timothy P S, Liu Hong. Effects of sequential pollination on the success of "fast" and "slow"pollen donors in Hibiscus moscheutos (Malvaceae) J. American Journal of Botany, 2000, 87(11):1656-1659.10 Spira T P. Reproductive biology of Hibiscus moscheutos J. In: Bock, J.; Linhart, Y., eds. 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The karyotype was 2A and the karyotype formulae was2n=2x=38=32m+6sm (2SAT). No abnormal behavior was observed in the meiotic process of pollen mother cell of Hibiscus moscheutos. There were nineteen bivalents (19) at metaphase, indicating itwas a typical diploid species.Keywords: Hibiscus moscheutos L.; chromosome; Mitosis; Karyotype; Meiosis