汗腺细胞来源的诱导多能性干细胞构建及【推荐论文】 .doc

精品论文汗腺细胞来源的诱导多能性干细胞构建及其鉴定秦明德，梁含思5（苏州大学江苏省干细胞与生物医用材料重点实验室，江苏 苏州 215000） 摘要：本文中获得汗腺细胞来源的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS）。方 法 从手术废弃幼儿手指中提取出汗腺，体外培养，待汗腺细胞生长约 10 天后，以 1×105 的密度接种于 6cm 细胞培养皿中，向汗腺细胞培养基中加入 4 种胚胎干细胞的转录因子基 因：Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的慢病毒。2-3 天后，消化接种到铺有滋养层细胞的 6cm 细10胞培养皿中，培养约 10 天后，挑选克隆和细胞形态与胚胎干细胞相同的克隆，接种于铺有 滋养层细胞的 24 孔板中。培养约 10 天后，再次挑选克隆和细胞形态与胚胎干细胞相同的克 隆，接种于铺有滋养层细胞的 6 孔板中。RT-PCR 和免疫荧光技术检测汗腺细胞标志基因： CEA、CK14 和 CK18；RT-PCR 检测诱导后细胞的人胚胎干细胞标志基因：Oct4、Sox2、 KLf4、c-Myc 和 nanong，免疫荧光技术检测是人胚胎干细胞表面标志基因：ssea3、ssea4、15TRA-1-60 和 TRA-1-81 以及核标志基因：Oct4。结果 1、RT-PCR 和免疫荧光技术检测从六 指中提取的细胞表达汗腺细胞的标志基因。2、RT-PCR 和免疫荧光技术检测诱导后细胞表 达人胚胎干细胞标志基因。结论 汗腺细胞经过四因子的诱导后，可重编程为诱导多能干细 胞。关键词：汗腺细胞；诱导多能干细胞; 重编程20中图分类号：Q254文献标志码：AConstruction and identification of Sweat gland cells derived induced poluripotent stem cellsQIN Mingde, LIANG Hansi25(Soochow University,Jiangsu Province Key Laboratory of stem cells and biomaterials,JiangSu SuZhou 215000)Abstract: In this paper，induction of pluripotent stem cells from sweat gland cells ( inducedpluripotent stem cell, iPS ). Methods six children sweat gland, extracted from the cultured in vitro, the sweat gland cells grown for about 10 days, with 1 * 105 were inoculated in 6cm cells in a Petri30dish, to sweat gland cell culture into 4 human embryonic stem cell transcription factor gene: slowvirus Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. After 2-3 days, digested and inoculated onto human trophoblast cells 6cm cells in a Petri dish, after about 10 days of culture, the clones and the morphology of the cells and embryonic stem cells were inoculated in the same, with a 24 orifice plate of trophoblast cells. After about 10 days of training, again selected cloning and cell35morphology and embryonic stem cells were inoculated in the same, with a 6 orifice plate of trophoblast cells. RT-PCR and immunofluorescence detection of sweat gland cell marker genes: CEA, CK14 and CK18; cell marker gene of human embryonic stem cells was detected by RT-PCR: Oct4, Sox2, KLf4, c-Myc and Nanong, immunofluorescence detection technology is the human embryonic stem cell surface marker genes: ssea3, ssea4, TRA-1-60 and TRA-1-81 as well40as a nuclear marker gene: Oct4. Results of the 1, RT-PCR and immunofluorescence detection from six refers to extract cell marker expression of sweat gland cell gene. Human embryonic stemcell marker gene expression of 2, RT-PCR and immunofluorescence detection of induced cells. Conclusion the sweat gland cells after induced by four factors, can be reprogrammed to induced pluripotent stem cells.45Keywords: Gland cells; Induced pluripotent stem cells; Reprogramming基金项目：教育部博士点新教师基金（20093201120011）作者简介：秦明德，（1978-），男，副教授，干细胞生物学。E-mail: qinmingde- 7 -0引言汗腺是皮肤的一个附属机构，是排汗的承担者，没有汗腺的皮肤如疤痕等不能排汗。深 度烧伤病人伤愈后，在创面形成疤痕组织，但是由于疤痕组织不含有汗腺，从而不能排汗，50大大影响了病人的生活质量。大面积深度烧伤病人的烧伤面积甚至可达到 98%，随着医疗 卫生的改革和居民生活水平的提高，大面积深度烧伤病人的存活率越来越高，病人伤愈后需 要大量的汗腺细胞来修复皮肤，使其恢复排汗功能。而从病人皮肤获取的汗腺细胞在体外增 殖能力有限，难以满足大面积皮肤排汗功能修复的需要，使得皮肤的排汗功能修复在应用到 临床方面进展缓慢。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS）是向体细胞转染与55细胞干性有关的 4 因子 Oct4、Sox2、KLf4 和 c-Myc，使体细胞经过重编程逆分化而形成的一类干细胞。研究表明诱导多能干细胞是类似于胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）， 可以向三胚层分化1。所以可以设想通过制备汗腺来源的诱导多能干细胞，经扩增后再诱 导分化为汗腺细胞的方法来间接获得大量的汗腺细胞。本实验通过从手术废弃幼儿手指皮肤 中获取汗腺细胞，经过 4 因子转染，重编程汗腺细胞为 iPS 细胞，为进一步的科学研究和临60床应用打下基础。1材料与方法1.1 标本来源标本来自苏州市儿童医院，是手术废弃幼儿手指取下的皮肤。标本在无菌条件下获取、 处理，并且获得家属知情同意书。651.2 主要实验材料和仪器特级胎牛血清(GIBCO 公司)；KnockOut 血清（GIBCO 公司）；DMEM/F12 细胞培养基（Hyclone 公司）；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠（GIBCO 公司）；氢化可的松(SIGMA 公司)； 表皮生长因子（R&D 公司）；-2-巯基乙醇（GIBCO 公司）；FGF-based（PEPRO TECH 公司）；非必需氨基酸（GIBCO 公司）；四型胶原酶（SIGMA 公司）；慢病毒 Oct4、Sox2、70Klf4 和 c-Myc（本实验室构建）；抗 CEA、SSEA3、SSEA4、TRA-1-60 和 TRA-1-81 鼠来 源的单克隆抗体（ebiosience 公司）；抗 CK14 和 Oct4 鼠来源的单克隆抗体（Santa Cruz 公 司）；抗 CK18 鼠来源的单克隆抗体（Chemicon 公司）；倒置显微镜（Olympus 公司）； EVOS 型荧光显微镜（东胜创新生物公司）。1.3 汗腺细胞的提取、培养及鉴定75从医院获取手术废弃幼儿手指（经患者家属同意），剥离皮肤，去除脂肪层和肌肉层， 将皮肤剪成 1mm2 大小，用 5mg/mL 四型胶原酶 37消化 4 小时，在倒置显微镜下提取出 汗腺，接种于铺有 I 型胶原的 6cm 培养皿和 24 孔板中。用含 10%特级胎牛血清、10g/L 表皮生长因子、2mmol/L 三碘甲状腺原氨酸、0.4mg/L 氢化可的松、1%胰岛素-转铁蛋白-亚 硒酸钠、2mmol/L L-谷氨酰胺、0.1U/L 青霉素和 0.1ug/L 链霉素的 DMEM/F12 细胞培养基，80于 37、5%CO2 的细胞培养箱中培养。培养 5 天后，0.05%胰酶消化 2min，轻轻吹打，除 去成纤维细胞。再继续培养约 10 天后，RT-PCR 方法检测测细胞是否表达 CEA、CK14 和 CK18，以角质化细胞作为角蛋白基因的阳性对照；免疫荧光染色检测汗腺细胞标志物 CEA、 CK14 和 CK18 表达情况。精品论文8590951001051.4 汗腺细胞来源的 iPS 诱导及鉴定待汗腺细胞长到约 10 天后，用 0.017%胰酶消化 10min，0.034%胰酶消化 3min，0.05% 胰酶消化 2min 分阶段消化汗腺细胞，以 1×105 的细胞密度接种于 6cm 细胞培养皿中。第 二天加入 1×106U 的 4 因子 Oct4、Sox2、KLf4 和 c-Myc 慢病毒悬液和等体积的汗腺细胞培 养基以及 10mg/L PolyBrin。第三天 PBS 冲洗，除去多余的慢病毒，继续用汗腺细胞培养基 培养。第四天换成胚胎干细胞培养基：含 20%KnockOut 血清、1%非必需氨基酸、0.1mmol/L -2-巯基乙醇、4g/L FGF-based、2mmol/L L-谷氨酰胺、0.1U/L 青霉素和 0.1ug/L 链霉素 的 DMED F12 细胞培养基。待换成胚胎干细胞培养基 3 天后，用胰酶消化，将该皿中细胞 以 1:3 的密度接种于事先铺有 MEF 的 6cm 细胞培养皿中，加入胚胎干细胞培养基。经过 10 天的培养，将细胞核质比高，边缘明显的克隆挑选于事先铺有 MEF 的 24 孔板中。经过 10 天培养，再挑选细胞核质比高，边缘明显的克隆，接种于 6cm 细胞培养皿中大规模培养。 RT-PCR 检测 iPS 细胞是否表达 Oct4、Sox2、KLf4、c-Myc 和 nanog，分别以汗腺细胞和胚 胎干细胞为阴性和阳性对照。用免疫荧光技术，检测细胞胚胎干细胞标记物 Oct4、ssea3、 ssea 4、TRA-1-60 和 TRA-1-81 的表达情况。2结果2.1 汗腺细胞的培养及鉴定汗腺第 1 天培养时，细胞未长出，能够看到明显的汗管结构。经过 3-4 天培养，汗腺细 胞开始从汗腺中长出，呈典型的上皮细胞状，细胞生长紧密，细胞呈多角形，边界明显，细 胞核清晰。RT-PCR 显示汗腺细胞表达 CEA、CK14 和 CK18（图 1），角质化细胞不表达 CEA，只表达角蛋白 CK14 和 CK18。免疫荧光染色显示汗腺细胞表达 CEA、CK14 和 CK18（图 2），证明从皮肤中提取培养出的为汗腺细胞。图 1 汗腺细胞的形态以及 RTPCR 鉴定A、 汗腺细胞在倒置显微镜下（×40）不同时间段的形态 B、RTPCR 汗腺细胞和角质化细胞的 CEA、CK14 和 CK18 表达水平比较，汗腺细胞表达 CEA 和角蛋白基因110115120125图 2 提取培养的细胞表达汗腺细胞标志因子通过免疫荧光染色鉴定汗腺细胞。a、d、g 分别为汗腺细胞 CEA、K14、K18 染色；b、e、h 为汗腺细胞的核染色；c、f、i 为汗腺细胞 CEA、K14、K18 染色和和染色，红色为相应的 CEA、K14、K18 蛋白，蓝色为细胞核2.2 汗腺细胞来源的 iPS 的诱导及鉴定汗腺细胞经诱导形成 iPS 后，细胞形态改变，与汗腺细胞差异显著，形成的 iPS 克隆形 态与 ESC 克隆形态相似，细胞生长紧密，边界不明显，核质比高，核仁清新，在细胞周围 有大量代谢产物，RT-PCR 显示汗腺细胞 iPS 表达人胚胎干细胞的关键转录因子 Oct4、Sox2、 KLf4、c-Myc 和 nanong（图 3），说明汗腺细胞来源的 iPS 与人胚胎干细胞的基因表达相似。 免疫荧光技术显示汗腺细胞来源的 iPS 中的人胚胎干细胞核标志因子 Oct4 以及膜表面标志 因子 ssea3、ssea4、TRA-1-60 和 TRA-1-81 表达均呈阳性（图 4），即汗腺细胞来源的 iPS 与人胚胎干细胞的标志性蛋白表达相似。图 3 SGC-iPS 形态和 RT-PCR 鉴定A: a、b、d 分别为汗腺细胞、诱导多能性干细胞、人胚胎干细胞（×40）；c、诱导多能性干细胞（×400）；B、RT-PCR 检测汗腺细胞来源的诱导多能性干细胞表达人胚胎干细胞的标志基因 Oct4、Sox2、KLf4、c-Myc和 nanong，SGC-iPS 表达 hESC 的标志基因130135图 4 汗腺细胞 iPS 表达 hESC 的标志蛋白a、d、g、j、m 分别为 Oct4、ssea3、ssea 4、TRA-1-60 和 TRA-1-81 染色；b、e、h、k、n 为核染色；c、f、i、l、o 为相应的 Oct4、ssea3、ssea 4、TRA-1-60 和 TRA-1-81 染色和核染色；红色为相应的蛋白，蓝色为 细胞核，紫色为细胞核上的蛋白，ssea3、ssea 4、TRA-1-60 和 TRA-1-81 是膜蛋白，Oct4 为核蛋白，与 DAPI共同染色呈紫色。SGC-iPS 的各项干细胞指标均为阳性。1401453讨论近年来，研究汗腺细胞的实验室和机构越来越多，对于汗腺的提取和汗腺细胞的培养已 越来越成熟。但是目前对于汗腺的鉴定还没有特异性的抗原标志物，通常选择癌胚抗原 CEA 和角质化蛋白如 CK8、CK14、CK18 和 CK19 等作为作为汗腺细胞的特异性标志物2,3。我 们分别从人胸腹部和六指提取汗腺细胞，发现从六指中更容易获得足够量的汗腺细胞。本实 验从手术废弃幼儿手指的皮肤中提取出汗腺，经过培养以及除去成纤维细胞后，细胞呈铺石 路状生长，RT-PCR 技术和免疫荧光技术检测培养的细胞表达癌胚抗原和角蛋白，证明为汗 腺细胞。目前，国内外对于汗腺细胞的研究多着手于干细胞向汗腺细胞分化。盛志勇等4用骨 髓来源的 MSC 与热损伤的汗腺细胞共培养，使骨髓 MSC 向汗腺细胞分化，表达汗腺细胞 标志基因 CEA 和 CK19，并且通过体内实验，分化后的细胞可以发育成汗腺，使受损失的 皮肤恢复排汗功能。罗文跃等5，将 hESC 培养于人羊膜表面，诱导 hESC 向表皮干细胞分 化，再将表皮干细胞与汗腺细胞共培养，使之分化为汗腺细胞。Shikiji 等6将表皮干细胞 接种于成纤维细胞和胶原材料的复合物中，进行三维培养，使表皮干细胞分化发育成具有具150155160165170175180185190有导管样的汗腺。但是，由于 hESC 涉及到伦理问题，MSC 和表皮干细胞在体外向汗腺细胞分化，受到培养条件的限制，难以获得大规模汗腺细胞，所以迟迟没有应用到临床上的大 面积深度烧伤病人的汗腺修复。2006 年，日本科学家 Takahashi 等7应用导入与干细胞干性有关的因子，导入到鼠的成 纤维细胞，使之去分化重编程为具有 ESC 特性和分化潜能的 iPS 细胞。用同样的方法， Takahashi 等8又制成人来源的 iPS 细胞，这种细胞能像三胚层分化，并且体内注射可形成 畸胎瘤。iPS 的发现，开创了干细胞研究的新纪元，打破了只能由干细胞向体细胞分化的规 则，为我们获取干细胞提供了一条新的路径。本研究用传统的 iPS 方法，通过慢病毒向 SGC 转染 4 因子，使之去分化重编程为 SGC-iPS。所获得的 iPS 细胞克隆与 hESC 形态相似，核 仁清晰，高核质比，通过 RT-PCR 检测，SGC-iPS 表达 Oct4、Sox2、KLf4、c-Myc 和 nanong； 免疫荧光染色技术检测，SGC-iPS 表达 hESC 的标志基因 Oct4、ssea3、ssea 4、TRA-1-60 和 TRA-1-81，证明本实验获得的细胞为 iPS 细胞。iPS 是由供体体细胞去分化而来，不存在免疫排斥问题，同时克服了 hESC 的伦理问题， 而且在体外向汗腺细胞诱导分化具有其他干细胞不具备的优越性。Dimos 等9发现，家族 型肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者的上皮细胞来源的 iPS 细胞，具有该疾病的特异性特点。不 同组织来源的 iPS 具有不同组织的记忆性，更加容易向该来源的组织分化。SGC-iPS 是来源 于 SGC 的干细胞，相比于 MSC 和 hESC 等干细胞，更容易向汗腺细胞分化。有研究发现 10-12，从不同组织来源的细胞中提取出 MV 可诱导干细胞向该来源的细胞分化。可以设 想从 SGC-iPS 中提取出 MV，来诱导其他干细胞向汗腺细胞分化。iPS 技术正在高速发展，Stadtfeld 等13利用腺病毒为载体，转染四因子，因子短时间 内高表达，而且不参与永久整合，得到较为安全的 iPS。随着科学的发展，iPS 的致瘤行将 得到解决，安全性将大大的提高。本研究制备了汗腺细胞来源的 iPS 细胞，探索了体外可以 大量获得修复汗腺的种子细胞，为大面积深度烧伤的病人恢复排汗功能提供了一个可行的方 法。但是具体干细胞向汗腺细胞分化的机制以及 iPS 用于临床治疗还需要进一步的探索。致谢感谢雷肖教授提供慢病毒载体；金颖教授提供人 ESC 株（SHhES2）。这项工作是由教 育部博士点新教师基金（20093201120011）资助完成。参考文献:1 Zhao XY, Li W, Lv Z, Liu L, Tong M, Hai T,et al.iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation.Nature,2009;461(7260):86-90.2 Cai S, Pan Y, Han B, Sun TZ, Sheng ZY, Fu XB.Transplantation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells transfected with ectodysplasin for regeneration of sweat glands.Chin Med J (Engl),2011;124(15):2260-8.3 Xu Y, Huang S, Ma K, Fu X, Han W, Sheng Z.Promising new potential for mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord Wharton's jelly:sweat gland cell-like 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Regeneration of functional sweat gland-like structures by transplanted differentiated bone marrow mesenchymal stem cells. Wound Repair Regen,2009;17(3):427-35.5 罗文跃,龙丽芸,李志红。体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺细胞分化的研究。赣南医学院学报，2012；32(2)。6 Shikiji T, Minami M, Inoue T, Hirose K, Oura H, Arase S.Keratinocytes can differentiate into eccrine sweat ducts in vitro: involvement of epidermal growth factor and fetal bovine serum.J Dermatol Sci，2003;33(3):141-50.7 Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cell from mouse embryonic and adult fibroblasts195200205cultures by defined factors. Cell，2006; 126 (4): 663-76.8 Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, et al. 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