拟南芥 ICEr2 元件反式作用因子基因的克隆与分析1.doc

豆丁网精品论文拟南芥 ICEr2 元件反式作用因子基因的克隆与分析1王琪，朱延明，王冬冬 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨（150030） E-mail：wangqi198169摘要：低温、干旱、土壤盐渍化等非生物逆境环境会导致植物失水，严重时可造成细胞膨 压完全丧失，直至死亡。本研究以模式植物拟南芥为试验材料，以与抗逆密切相关基因 CBF2的启动子上游特定顺式元件 ICEr2 作为“诱饵”，利用酵母单杂交系统，克隆与其特异结合的 新转录因子基因AtbZIP1（At5g49450）；经结合特异性试验表明，AtbZIP1 基因在酵母体内和体外能够与 ICEr2 元件特异结合，并能够激活下游报告基因 HIS3 的表达；利用 Real-timePCR 方法和拟南芥渗透胁迫芯片杂交数据库的结果共同分析其表达特性，发现 AtbZIP1 基因 可以在拟南芥的根和茎中表达，而且盐分可以诱导它在根中的高量表达。本研究对阐明转录因子基因在植物渗透胁迫信号转导中的调控作用、抗渗透胁迫功能基因的调控表达以及渗透胁迫相关应答机制奠定了重要理论基础。 关键词：ICEr2；AtbZIP1；拟南芥；转录因子 中图分类号：Q71. 引言伴随基因组学研究的蓬勃发展，在 GeneBank 中登录的基因数目急剧增加， 当前重视 这一发展趋势，并充分利用网上资源，将使筛选新基因及鉴定基因功能的工作更方便快捷。 目前这方面的研究很多集中在对转录因子基因的克隆与功能鉴定上。真核生物中各种转录因 子在转录水平的调控是基因表达调控的重要方式之一。 转录因子一般都含有 DNA 结合区 与转录调控区， 通过与特异性的 DNA 元件的相互作用来调控生物体内相关靶基因在特定 条件（如环境胁迫）、特定组织中定时定量地表达。因此，要阐明细胞内各种信号转导与调 控基因表达的机制， 鉴定各种调控基因表达的 DNA 元件和转录因子至关重要。干旱，高盐及低温是影响植物生长发育和农作物产量的限制因素。当植物受到这些非生 物逆境胁迫时，植物本身会发生一系列的生理生化变化，引发特异性胞内信号通路的激活或 抑制，以对逆境刺激做出相应的反应。属于 AP2 家族的 CBF/DREB(C-repeat binding factor/dehydrate responsive element binding factor)途径已被证实是赋予植物低温抗性的主效 途径，因而使其成为低温抗性领域研究的热点之一。作为冷应答反应主效途径的 CBF/DREB 信 号 通 路属于非 ABA 依 赖，拟 南芥中 存在 大量 启动子 内具 DNA 顺式元 件 CRT(C-repeat)/DRE(dehydration response element )1的冷响应基因 (cold responsive, COR)，CRT/DRE 以 CCGAC 为核心保守识别区。反式作用因子 CBF/DREB 在低温及脱水胁迫条件下与该元件特异作用，从而激活下游 COR 基因的转录表达。COR 基因在低温条件下 的特异表达对植物的逆境生存具有十分重要的意义，其编码产物既可能是对细胞起保护作用 的蛋白质产物，也可能是次级转录因子，调控其他功能基因的特异表达。CBF/DREB 转录 因子家族分为干旱及高 盐 诱 导 的 DREB2 小 家 族 和 冷 诱 导 的 CBF/DREB1 小家 族。 后者由 CBF1/DREB1B，CBF2/DREB1C，CBF3/DREB1A，CBF4/DREB1D，DREB1E， DREB1F 组成，其中 CBF4/DREB1D 是渗透胁迫诱导的，而位于第 4 号染色体上 8.7kb 区 域内成簇排列的 CBF1、2、3 是该领域的研究热点1-3，三个 CBF 基因均为单外显子结构，1本课题得到国家自然科学基金资助项目(30570990),黑龙江省科技厅重点攻关资助项目(GB05B104)资助。具有很高的氨基酸同源性。Chinnusamy 等4分离到一个编码 bHLH（basic helix-loop-helix)结构的 MYC 类转录因子 (MYC-like transcription factors) ICE1，它能够识别 CBF3 启动子区域内的 MYC 转录因子结 合区域，并在低温诱导下激活 CBF3 表达，这一区域也被称做 ICE 盒(ICE Box)，ICE 作为 CBF 的上游调节因子正向调控其在低温条件下的表达，以主效开关的作用控制 CBF 信号传 导途径各组分的表达水平。然而，作为与 CBF3 途径平行的 CBF1，2 途径中，CBF1，2 基 因上游的调控因子还没有找到，即植物受到低温胁迫时，植物细胞是怎样将信号通过非 ABA 依赖的途径传递给 CBF1，2 转录因子，从而激活下游一系列功能基因表达的，这部分领域 的研究目前还是空白。Daniel 等5通过缺失突变的方法得到了拟南芥中编码低温胁迫相关基因 CBF2 上游存 在的 ICEr1(CACATG)和 ICEr2（ACTCCG）(induction of CBF expressionregion 1,2)顺式元件， ICEr1 或 ICEr2 元件对低温的响应很微弱，但是它们的同时存在可以积极的响应低温胁迫。 ICEr2 元件上没有明显的已知转录因子的结合位点，但是 ICEr1 存在一个保守的 bHLH 蛋白 结合位点（CANNTG）。本研究即以拟南芥中耐寒转录因子 CBF2/DREB1C 上游的特定顺式元件 ICEr2 为“诱 饵”，利用酵母单杂交系统克隆与之结合的转录因子即寻找转录因子基因的转录因子， 渴望通过挖掘调控渗透胁迫反应的“开关”之“开关”，最后找到引领全局的“总开关”，这将为 完善植物渗透胁迫信号转导途径和渗透胁迫相关应答机制的研究奠定理论基础。2. 材料与方法2.1 植物材料与胁迫处理植物材料为拟南芥（哥伦比亚生态型）。将拟南芥种子直播于草炭土：蛭石：石灰石（1:1:1） 混合的培养介质中，覆膜 5 天；在 22、人工光照（白色荧光灯，16 h 光照，8 h 黑暗， 光照强度为 4000lux )和空气相对湿度为 70%的培养箱中培养。待播种 3-4 周后，幼苗已经长 出却未出苔时，对其进行胁迫处理。分别取一部分拟南芥幼苗置于 4冷藏柜，或 30% (w/v)PEG 6000，或 200mM NaCl 分别处理 1h。处理后取样，将样品立即用液氮速冻，于-80 冰箱保存备用。2.2 菌株，载体和试剂用于转化和筛选的酵母菌株 Y187 购自大连宝生物公司（Takara, Japan）。用于诱饵质粒 转化和载体构建的大肠杆菌 DH5、用于原核表达产物诱导的大肠杆菌 BL21(DE3) , pET-32b 由东北农业大学植物生物工程研究室保存。pGEM-T Vector 购自 Promega, Madison,USA 公 司，BD Matchmaker Library Construction &Screening Kits 购自大连宝生物工程公司（Takara, Japan）。2.3 拟南芥 dscDNA 文库的构建用 Trizol(Invitrogen)法提取经 4冷处理, 30% (w/v)PEG 6000，和 200mM NaCl 分别处 理 1h 的拟南 芥幼苗 总 RNA ，以 Clontech 试剂盒中提供 的 CDS III 引物 (5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3) ， SMART III Oligonucleotide（5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3）和 MMLV 反转录酶 进行反转录，利用 LA-Taq 酶进行 PCR 反应扩增得到双链 cDNA（ds cDNA）文库。2.4 酵母表达载体的构建和酵母单杂交筛选为构建诱饵质粒，人工合成 ICEr2 元件（ACTCCG）或突变 m1ICEr2 元件(ACTACG), m2ICEr2(CAGAAT)元件，在顺式元件（或突变元件）两端设计保护碱基，5端加入 AGA ，3端加入 CGT。并将加完保护碱基后的序列设计成串联四联体。最后根据 pHIS2 载体上多 克隆酶切位点，在串联四联体两端加入酶切位点，5端为 EcoR I，3端为 Sac I。（ICEr2-1:5-AATTCAgAACTCCgCgTAgAACTCCgCgTAgAACTCCgCgTAgAACTCCgCgTgAgCT-3;IC Er2-2:5-CACgCggAgTTCTACgCggAgTTCTACgCggAgTTCTACgCggAgTTCTg-3;m1ICEr2-1:5-AATTCAgAACTACgCgTAgAACTACgCgTAgAACTACgCgTAgAACTACgCgTgAgCT-3;m1ICEr2-2: 5-CACgCgTAgTTCTACgCgTAgTTCTACgCgTAgTTCTACgCgTAgTTCTg-3; m2ICEr2-1:5-AATTCAgACAgAATCgTAgACAgAATCgTAgACAgAATCgTAgACAgAATCg TgAgCT-3;m2ICEr2-2:5-CACgATTCTgTCTACgATTCTgTCTACgATTCTgTCTACgATTCTgTCTg- 3）。将人工合成的片段进行退火，并连入诱饵质粒载体 pHIS2（购自大连宝生物公司）的 EcoR I 和 Sac I 位点， 转化入 E.coli DH5 感受态细胞，分别命名为 pHIS2- ICEr2，pHIS2- m1ICEr2，pHIS2- m2ICEr2。在酵母单杂交系统的筛选中，将 Sma I 线性化的 pGADT7- Rec2 ，ds cDNA 文库和 pHIS2-ICEr2 共转化入酵母 Y187 感受态细胞中（LiAc 法，参见 BD MatchmakerTM Library Construction & Screening Kits User Manual, Clontech），将转化子涂布在含有 125mM 3-AT 的 SD/-His/-Leu/-Trp 培养基上，30培养 7 天左右，直到有菌落长出。挑选直径>2mm 的菌落 分别在含有 250 mM 3-AT，300 mM 3-AT 的 SD/-His/-Leu/-Trp 培养基进行划线，培养 4-6 天，选择在高浓度 3-AT 的作用下长势较好的菌落，提取酵母质粒，转化 E.coli DH5 感受 态细胞，利用 T7 引物进行测序分析。酵母体内结合特异性的验证，也采用酵母单杂交系统进行。将 pGADT7-bZIP1 和 pHIS2， pHIS2-ICEr2，pHIS2-m1ICEr2，pHIS2-m2ICEr2 共转化入酵母 Y187 感受态细胞中（LiAc 法，同上），将转化子涂布在含有 0mM 3-AT 的 SD/-His/-Leu/-Trp 培养基上，30培养 7 天 左右，直到有菌落长出，分别挑取菌落，接种于 5ml125mM 3-AT SD/-His/-Leu/-Trp 培养基 中，并划线于 0mM 3-AT ，200mM 3-AT SD/-His/-Leu/-Trp 培养基上。2.5 凝胶阻滞电泳（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）AtbZIP1 基因的编码区克隆到 pET-32b 载体上，并在 E.coli BL21（DE3）中表达出含 6His 标签的融合蛋白。将人工合成的 ICEr2 元件，m1ICEr2 元件，m2ICEr2 元件退火，利用地高 辛标记 DNA（DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter kit，Roche）。结合反应的 体系为 15µL6 ：标记 的探针 (20fmol,2ng) 、 57µgAtbZIP1 蛋白、结 合缓冲液 (20mmol/LTris-HCl(pH7.6) 、 30mmol/KCl 、 0.2%(w/v)Tween20 、 1mmol/LEDTA 、1mmol/LDTT(二硫苏糖醇)、10mmol/L(NH4)2SO4，1×)和 13µg 小牛胸腺 DNA(Sigma)，25 水浴 30min。反应混合物在 6%的非变性 PAGE 胶中电泳，缓冲液为 0.5×TBE (45mM Tris-borate，1mM EDTA)，25v，3 小时，采用直接接触转膜法，免疫杂交信号检测按照 DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter kit(Roche)的操作程序进行。2.6AtbZIP1 基因的表达特性分析用 Trizol(Invitrogen)法提取不同处理的拟南芥幼苗总 RNA，并用 DNAase I 出去基因组DNA 的污染。利用 SuperScript TM （Clontech）反转录酶进行 cDNA 第一链的合成，20µL体系中包含 5µgRNA。根据 ABI Prism 7300 Sequence Detection System 对实时荧光定量 PCR体系的要求，设计了 AtbZIP1 基因的引物序列，并合成了内参基因 actin 的引物。引物设计 应 用软件 Primer Premier5.0 的 Primer 命令。 各引物 序列如 下： P1-sense: 5ACAAgTTCAggTgCCgACATAg-3;P1-anti:5-TTCgTCgTTCAggACTggAgAT-3;Actin-sense:5-CTgTgCCAATCTACgAgggTT-3;Actin-anti:5-AgAgCTggTCTTTgAggTTTCC-3。PCR 反应体系：20µL 2×SYBR Green PCR MasterMix（1×），1µL P5（0.25 µM），1µL P3（0.25 µM），16µL ddH2O，2µL 模板 DNA。PCR 反应条件：9530s, 955s，6020s，40个循环。利用在 TAIR 网站（http:/www.arabidopsis.org/index.jsp）上公布的拟南芥渗透胁迫芯片 杂交结果，对所有的芯片结果按照不同处理，处理时间，处理部位进行归类，对归类后的结 果进行方差分析并做图。3. 结果与分析3.1 与拟南芥 ICEr2 元件结合转录因子基因的克隆为了从拟南芥中筛选和报告载体 pHIS2-ICEr2 相互作用的蛋白质因子，我们构建了拟南 芥受 200mM NaCl 处理，30%PEG6000 处理和 4处理混合的叶片 cDNA 文库。以拟南芥总 RNA 为模板，以引物 CDS Oligo (dT)为引物，利用 MMLV 反转录酶进行反转录，将反转 录产物用 RNase H 处理后，用于文库的构建。为了除去 PCR 反应中的酶、引物，以及小 于 200bp 的片段，我们利用 BD CHROMA SPIN TE-400 Column 层析的方法纯化 PCR 产 物。采用大规模 LiAc/PEG 法将报告载体 pHIS2-ICEr2、线型文库载体 pGADT7-Rec2 和双 链文库 DNA 片段共同转化酵母 Y187 感受态细胞。由于双链文库 DNA 片段的两端和 pGADT7-Rec2 的两端具有一定的同源性，可以发生同源重组，因此，双链文库 DNA 片段 可以整合到 pGADT7-Rec2 载体中，形成环状的结构，这样酵母就可以在缺乏亮氨酸的培 养基中生存。将转化子涂布在含有 SD/-His/-Leu/-Trp+125mM 3-AT 的固体培养基中，30 培养 7 天。7 天后，在培养基上出现了大量的菌落。进行菌落计数，计算得知转化效率为1.2×107，为了提高筛选的效率，降低假阳性，我们只对直径大于 2 毫米的菌落进行下一步 的分析。根据 pGADT7-Rec2 载体中双链 DNA 插入区段的两侧设计了引物 AD-LD sense 和 AD-LD anti，分别利用无菌牙签在菌落中挑取少量酵母菌进行 PCR，经过此步 PCR 筛 选，共获得直径大于 2 毫米，且插入片段长度大于 750bp 的菌落共 1805 个。我 们 将 1805 个 PCR 检 测 片 段 大 于 750bp 的 菌 落 接 种 到 1ml 的 SD/-His/-Leu/-Trp+120mM3-AT 的液体培养基中，培养 36h 。分别用接种环将菌液划线在含有 240mM 3-AT 的 SD/-His/-Leu/-Trp 固体培养基中，30培养 7 天。不同酵母细胞中蛋白因子与 DNA 序列 作用的效果不一样，作用强的能长出很多的菌落来，作用弱的只能长出很小很少的菌落来。 在所挑选的 1805 个酵母中，我们得到了 186 个可以长出较大菌落的阳性克隆。我们将上两 步筛选得到的 186 个阳性克隆分别挑取菌落，并接种到 0.5ml 的 SD/-His/-Leu/-Trp+120mM3-AT 的液体培养基中，培养 36h 。分别用接种环将菌液涂布在含有 300mM 3-AT 的 SD/-His/-Leu/-Trp 固体培养基中，30培养 7 天。经过此步复筛，我们得到了 72 个可以长 出较大菌落的酵母来。提取酵母质粒，以 1µL 酵母质粒为模板，以 AD-LD sense 和 AD-LD anti 为引物进行 PCR 反应，扩增出插入在文库载体 pGADT7-Rec2 上的目的片段，将 PCR 产物纯化后，送交测序，测序引物为 T7。结果得到第 20 号克隆与拟南芥的一个能和 DNA 结合的转录因子在 50 个氨基酸上具有88的相似性，这个转录因子是 AtbZIP1（登录号为 At5g49450）。它具有典型的转录因子特征，推测它可能是我们所要查找的目的转录因子基因。将 AtbZIP1 基因的全序列提交到NCBI 网站的 Blast x 工具上进行同源比对。结果 AtbZIP1 基因只与它本身相似性最高，其次是与大豆中的 bZIP41 转录因子具有同源性，但是也只是 一段区域匹配，说明克隆的 AtbZIP1 确实是一个新的转录因子基因，且该基因的基因功能等 信息还没有进行深入的研究。3.2 拟南芥 AtbZIP1cDNA 的核苷酸序列和预测的氨基酸序列分析AtbZIP1 基因全长为 907bp, 在 317bp 有一个翻译起始密码子，而在 754bp 有一个终止 密码子。因此，AtbZIP1 基因含有一个 316bp 的 5非编码区、一个 437bp 的编码区和一个153bp 的 3非编码区。编码区编码 145 个氨基酸的多肽，分子量约为 16kD，等电点约为 9.30。 原子数为 2268 个，分子式为 C677H1138N216O229S8 。N 末端为甲硫氨酸，在酵母体内的半衰 期>20 小时。AtbZIP1 蛋白定位在细胞核内，没有信号肽序列或叶绿体、线粒体定位序列（图1）。使用 JPred 服务器对 AtbZIP1 蛋白的二级结构进行预测，结果如图 2 所示：图 1 拟南芥 AtbZIP1 基因的核苷酸序列和氨基酸序列 氨基酸序列以单个字母表示；预测的蛋白质结构域下面有下划线；终止密码子以星号表示。Fig 1 Nucleotide sequences and deduced sequence of amino acid residues of AtbZIP1gene.The amino acid residues are indicated by a single letter code. The putative DNA binding domainis underlined; Atermination codon is marked with asterisk;-HHHHHHHHHHH-HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-EEEE-HHHHH-图 2 拟南芥 AtbZIP1 蛋白的二级结构预测图（H=螺旋，E折叠，无预测结构）Fig 2 Secondary structure prediction of AtbZIP1 protein in Arabidopsis(H = helix, E = strand, - = no prediction)在 TAIR 数据库中查找到拟南 芥 bZIP 转录因子家族 的 71 个成员 ，（http:/www.arabidopsis.org/browse/genefamily/bZIP.jsp），分为 10 个组（group），仅能下载 到其中的 69 个 cds 序列，用 ClustalX 1.83 对 69 条序列进行多序列比对。结果如图 3 所示， 可以看出在结构域区域，AtbZIP1 蛋白与其它的 68 个 bZIP1 家族成员中的大部分具有较高 的相似性，但是其中 AtbZIP54，AtbZIP55，AtbZIP41，AtbZIP58，AtbZIP15 属于例外，它 们即使在结构域部分也与其它的 bZIP1 家族成员相似性很低，可能在进化上属于独立的一支 与其它成员分离开来。图 3 AtbZIP1 与拟南芥 bZIP 类家族蛋白的结构域编码区序列比较相同的氨基酸序列分别用不同颜色框框起; 序列中的原点代表缺少的氨基酸;Fig.3 Comparison of the deduced amino acid sequence of bZIP family protein in ArabidopsisThe same nucleic acid is framed separately by different colo（r A: Red; B: Green; C: Light blue; G: range）; The origin in sequence represent the absent amino acid.由于大多数的基因/蛋白家族起源较早，序列分化程度较大，相互之间较为远源，一般使用 NJ、ME 或者 ML 的方法。从多序列比对结果也可以得出，bZIP 家族蛋白除结构域部 分的相似程度较低，因此，我们选择 NJ（Neighbor-Joining，邻接法）进行进化树的构建， 采用 Poisson Correction（泊松修正）模型，Bootstrap 的值设为 1000。得到的结果如图 4 所 示，其中 AtbZIP1 属于起源较早的一支，与它亲缘关系较近的是 AtbZIP4，AtbZIP5，而且 后者 AtbZIP1 的分支。图 4 拟南芥中 bZIP 类家族蛋白的系统发生分析Fig.4 Phylogenetic tree representing the relationshipamong bZIP family protein in Arabidopsis.3.3 AtbZIP1 转录因子与 ICEr2 元件在酵母体内的结合特性分析将测序验证正确的 pHIS2-m1ICEr2 和 pHIS2-m2ICEr2 载体，连同 pHIS2 空载体和 pHIS2-ICEr2 载体，分别与 pGADT7-Rec2-bZIP1 载体（从第 20 号克隆的酵母菌中分离提取 酵母质粒，将其转化到 E.coli DH5 中，通过添加氨苄抗性将文库质粒 pGADT7-Rec2-bZIP1 分离 出来）组合 ，共同转 入酵母感受 态细胞中 ，将菌液分 别涂布在 含 有 0mM3-AT+SD/-His/-Leu/-Trp 的固体培养基中，30培养 7 天。待菌落长出后，将菌 落 接 种 到1ml 的 125mM 3-AT +SD/-His/-Leu/-Trp 的液体培养基中，培养 36h。分别用接种环将菌液划 线在含有 0mM 3-AT，200 mM 3-AT 的 SD/-His/-Leu/-Trp 固体培养基中，7 天后，观察菌 落在固体培养基上的生长情况。如图 5 所示，pHIS2 空载体组，pHIS2-ICEr2 组， pHIS2-m1ICEr2 组和 pHIS2-m2ICEr2 组在 0mM3-AT +SD/-His/-Leu/-Trp 的固体培养基都能够生长良好，可以长出较多的菌落。而当 3-AT 的浓度加大到 200 mM 时，只有 pHIS2-ICEr2组能够生长出相对较多的菌落，而其它三个仅在顶部菌液较浓的地方有菌的生长。结果说明， 只有 ICEr2 元件能够与 AtbZIP1 转录因子特异结合，而 pHIS2 空载体，单碱基突变元件 m1ICEr2 和 完全突变元件 m2ICEr2 均不能和 AtbZIP1 转录因子特异结合。同时，我们还发 现，pHIS2-m1ICEr2 组相对于 pHIS2 空载体组和 pHIS2-m2ICEr2 组，其菌落的生长情况要 稍好一些，推测 ICEr2 元件 ACTCCG 中的第 4 位 C 可能不是 AtbZIP1 转录因子识别的关键 位点。而有关 ICEr2 元件与 AtbZIP1 转录因子相互作用的核心序列的鉴定还需进一步的工作。AB图 5 AtbZIP1 基因在酵母体内结合特异性分析图 A、B 分别表示转化有 pHIS2-ICEr2, pHIS2, pHIS2-m1ICEr2,pHIS2-m2ICEr2 的酵母菌株在含不同浓度 3-AT的 SD 培养基（-His/-Leu/-Trp）上的生长情况。（图 A：0mM 3-AT；图 B：200mM 3-AT）Fig.5 Analysis of ICEr2 cis-element binding specificity with AtbZIP1in yeast. Figure A, B illustrate the growth of transformants transferred by pHIS2-ICEr2, pHIS2,pHIS2-m1ICEr2,pHIS2-m2ICEr2 in SD medium(-His/-Leu/-Trp) with different concentration 3-AT. (Figure A:0mM 3-AT; Figure B: 200mM 3-AT)3.4 AtbZIP1 转录因子与 ICEr2 元件的体外结合特性分析构建原核表达载体 pET-32b-bZIP1，将其转化大肠杆菌 BL21(DE3)。因为我们的目的蛋 白仅有 16kD，而 pET-32b 载体上的多克隆位点前端存在 Trx tag, His tag, S tag 和 thrombin 等 共计约 150 个氨基酸的标签或信号肽，它们对目的基因的表达来说是一个负担，所以我们将 这些标签或信号肽切去，酶切位点设计为 Nde I 和 Hind III。同时将 pET-32b 转化大肠杆菌 BL21(DE3)，作为 AtbZIP1 原核表达的空载体对照。用液体 LB 培养基，在 37条件下活化 大肠杆菌 BL21(DE3 pET-32b)和 2 株 BL21(DE3)，当菌液浓度达到 OD600=0.6 时加入终浓度 为 1 mM 的 IPTG，20培养，诱导蛋白表达 6 小时。按照 2.2.6.1.3.2 的方法提取上述菌体 的总蛋白，按照 2.2.6.1.3.4 的方法进行 SDS-PAGE 分析。从图 6 中可以看出，与 BL21(DE3 pET-32b)相比较（泳道 1、2），2 株 BL21(DE3 pET-32b-bZIP1)总蛋白提取物均能在 18.4KD 附近出现了条带（泳道 4、6），与预期的蛋白质分子量基本相符，表明 AtbZIP1 基因在构建 的工程菌 BL21(DE3 pET-32b-bZIP1)中得到了有效的表达。1234M56116.0KD66.2KD45.0KD35.0KD25.0KD18.4KD14.4KD图 6 AtbZIP1 基因原核表达M：蛋白质分子量标准；泳道 1：IPTG 未诱导的 BL21(DE3 pET-32b)总蛋白；泳道 2：IPTG 诱导的 BL21(DE3 pET-32b)总蛋白；泳道 3、5：IPTG 未诱导的 BL21(DE3 pET-32b-bZIP1)总蛋白；泳道 4、6：IPTG 诱导 BL21(DE3 pET-32b-bZIP1)总蛋白。Fig. 6 Prokaryotic expression of gene AtbZIP1M: Protein Molecular Weight Marker; lane1: the whole cell protein of BL21(DE3 pET-32b) not induced by IPTG; lane 2: the whole cell protein of BL21(DE3 pET-32b) induced by IPTG; lane 3, 5:the whole cell protein of BL21(DE3 pET-32b-bZIP1) not induced by IPTG; lane 4, 6:the whole cell protein of BL21(DE3 pET-32b-bZIP1) induced by IPTG.为了证明 AtbZIP1 重组蛋白可以和 ICEr2 元件在体外的特异性结合，进行了电泳迁移 变动分析试验。首先用地高辛标记的方法对退火后的人工合成 ICEr2 双链进行标记，然后加 入不同浓度的 AtbZIP1 重组蛋白，室温结合 25 分钟后，进行非变性的 PAGE 电泳，结果 如图 7 所示。我们可以看出，单独的、ICEr2 元件泳道中（泳道 5）没有出现滞后的条带， 只是在前端有大量自由的探针。而加入目的蛋白之后（泳道 3，4，6），随着加入蛋白质数 量的增大，其滞后现象越来越明显。当加入的 AtbZIP1 重组蛋白达到 500ng 时，出现了非常 明显的滞后现象。相反，单碱基突变元件 m1ICEr2 和完全突变元件 m2ICEr2 与 500ng AtbZIP1 重组蛋白结合组（泳道 1，2）都没有滞后现象的出现。证明 AtbZIP1 重组蛋白可以和 ICEr2 元件在体外特异性的结合。123456图 7 m1ICEr2 元件，m2ICEr2 元件，ICEr2 元件与 AtbZIP1 重组蛋白结合1: m1ICEr2+500ng AtbZIP1 重组蛋白; 2: m2ICEr2+500ng AtbZIP1 重组蛋白; 3: ICEr2+10ng AtbZIP1 重组 蛋白; 4: ICEr2+100ng AtbZIP1 重组蛋白; 5: ICEr2 元件; 6: ICEr2+500ng AtbZIP1 重组蛋白.Fig 7. Electrophoretic mobility shift assay of with AtbZIP1 recombinant protein with m1ICEr2 element，m2ICEr2 element and ICEr2 element.1: m1ICEr2+500ng AtbZIP1 recombinant protein; 2: m2ICEr2+500ng AtbZIP1 recombinant protein; 3: ICEr2+10ng AtbZIP1 recombinant protein; 4: ICEr2+100ng AtbZIP1 recombinant protein; 5: ICEr2; 6:ICEr2+500ng AtbZIP1 recombinant protein.3.5 AtbZIP1 转录因子的表达特性分析分别提取经过低温、干旱和高盐处理 1h 后拟南芥幼苗的总 RNA，用于模板进行逆转录 和 real-time PCR 分析，以检测 AtbZIP1 基因表达量的变化。同时，以相同模板量扩增拟南 芥的 actin 基因作为内参对照，以确认各反应的模板使用量是相同的。设计了 AtbZIP1 基因特异引物 P1-sense/P1-anti，采用 real-time PCR 的方法对其表达模 式进行进一步的分析。分别设计了 3 个不同处理（与构建 cDNA 库处理条件相同）：30% (w/v)PEG 6000 处理 1h，4处理 1h，200mM NaCl 处理 1h。经溶解曲线分析，内参 actin 和 AtbZIP1 基因可扩增出单峰，且 3 次重复表现一致，证明扩增的特异性和重复性良好， 可用于 real-time PCR 试验。CT 表示目的基因 AtbZIP1 和内参基因 actin 的 CT 值的差异，根据得到的原始 CT 值计算处理后样品的差异表达倍数（2CT），取以 2 为底的对数（即CT 值），计算不 同处理的结果。结果显示（见表 1），经 real-time PCR 试验分析，4处理，30% (w/v)PEG 6000 处理和200mM NaCl 处理下，AtbZIP1 基因的表达水平都略有提高，并依次呈上升趋势。其中 200mM NaCl 处理情况下，AtbZIP1 基因的表达量最高，达到未经处理（即 CK）样品的 6.45 倍。表 1 real-time PCR 分析 AtbZIP1 基因表达特性Tab. 1 Expression characterization of AtbZIP1 gene by real-time PCRCT(P1)CT(Actin)CTCT2CTCK19.4318.640.790419.5016.882.121.332.51PEG20.6017.672.932.144.41NaCl20.8117.333.482.696.45表中的 CT(P1)，CT(Actin)均为三次重复的平均值。CT 为每一个处理的 CT(P1)值CT(Actin)值。CT 为每一个处理的CT 值CK 的CT 值。P1 即为 AtbZIP1 基因特异引