应用基因芯片检测饮用水源与自来水基因转录毒性.doc

精品论文应用基因芯片检测饮用水源与自来水基因转录毒性吴兵 1, 张宴 1, 厉以强 2，赵大勇 1, 张徐祥 1, 程树培 11.污染控制与资源化研究国家重点实验室及南京大学环境学院，南京，210093;2.江苏省环境监测中心站，南京，210036培，男，教授，博导，研究方向：环境生物技术及信息学，E-mail: chensp摘要：为了预警饮用水源及自来水的环境健康与人体健康风险，项目应用 MouseGenome 430A 2.0 基因芯片，检测研究了长江饮用水源及南京自来水的基因毒性。4 组受试小鼠 Mus musculus，分别饲喂长江饮用水源水、南京自来水、3.8g/L 苯 并芘（BaP）化学溶液、洁净水 90 天。以洁净水为对照，小鼠基因转录表达显著 中毒的数量顺序为：自来水>BaP 化学液>长江水源。3.8g/L 的 BaP 化学液致癌风 险指数 RQs 为 1310。因为南京自来水毒性强度>BaP 化学液，由此推论南京自来 水致癌风险指数 RQs 也1310；因为南京自来水毒性来自长江水源，由此推论长江 水源潜在的致癌风险指数 RQs 势必1310。长江饮用水源及其南京自来水潜在环境 健康和人体健康风险，需要前瞻决策控制。 关键词：基因芯片；长江；饮用水源；自来水；基因毒性长江是长三角地区沿岸城市（如南京，苏州等）的饮用水源，其污染状况直 接关系到沿岸居民的身体健康。在众多的监测长江污染报告中，关于环境健康与 人体健康风险的研究报道甚少1-3。本项目检测研究了长江南京饮用水源及南京 自来水，对小鼠的基因转录毒性，提出了预警长江饮用水源环境健康及南京自来 水人体健康的重要依据。传统的监测生物毒性方法，存在灵敏度低，向人体外推精准度差等问题。基 因芯片(DNA microarray)的出现，帮助解决了诸多传统毒理学的难题，提高了检测 基因毒理学的信息通量和参数准确性。自毒理芯片(ToxChip) 成功开发并用于预测 有毒化学物对人类基因组潜在的危险性以来，基因芯片技术已被深入地用于监测 污染物的基因分子毒性，包括探索环境致癌机理，对人体敏感基因的影响等4-6。 例如日本学者曾采用基因芯片监测自来水，受到隐孢子虫等病原微生物的污染。为了深入了解长江饮用水源和南京自来水潜在的基因毒性风险，本研究应用 了美国 Affymetrix 标准化基因芯片（GeneChip® Mouse Genome 430A 2.0），检测 了受试小鼠肝脏基因的转录表达水平，发现了长江饮用水源的环境健康的风险性， 以及南京自来水的人体健康风险性。基金：江苏省监测中心苏环监测（2007）65-0711, 江苏省科技厅BZ2007064，国家教育部WTWER0720- 6 -精品论文1 材料与方法1.1 受试动物染毒受试动物为昆明种（Mus musculus，KM）小鼠，体重 18 ± 1g，由 NJ 军事医学科学院实验动物中心提供。驯养 1 周后，用于饲喂试验。受试小鼠随机分为水 源水组、自来水组、3.8 g/L 苯并芘（BaP）化学溶液组、洁净水组共 4 组，每组 小鼠 20 只。长江饮水源水取自 BHK 水源，自来水为 BHK 水厂产品。阴性对照组 为未检测出 POPs 的农夫山泉水，阳性对照组为 3.8 g/L 的苯并芘饱和化学溶液。 受试小鼠自由取食和饮水。饲喂染毒 90 天。试验周期的第一个月每周称一次 体重，此后每两周称一次体重。试验周期结束后，取出肝脏 0.2g，迅速切成直径<0.5cm 的碎块，置于 QIAGEN 公司的 RNA laterTM 的 2ml 保存液中，之后提取mRNA，进入基因芯片的检测程序。1.2 基因芯片分析肝脏 mRNA 的提取和基因芯片的检测和分析工作，由上海晶泰基因有限公司 完成。基因芯片采用美国 Affymetrix 公司的 GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array， 此芯片可检测 1.4 万个目标基因的转录表达状况。检测后得到的荧光信号表达的强 弱作为判断基因转录分子毒性的依据。以洁净水阴性对照为标准，分别分析水源 水组、自来水组、BaP 组饲喂小鼠的基因表达情况，确定表达增强和表达减弱的基 因数目。以异常表达的基因数目为依据分析不同水体对小鼠的毒性风险7,8。2 结果与讨论图 1 小鼠体重变化2.1小鼠体重的变化图 1 显示各试验组的小鼠，在 14 周的试验周期之内的体重变化情况。从图 1 可以看出：在试验开始的前 4 周时间内，各组小鼠的体重呈现快速增 加的趋势，各组之间小鼠的平均体重差距不大，组内体重差异不明显。4 周后所有 试验组小鼠体重的增加速度减慢，试验组间小鼠平均体重的差异增大，但这种差 异并不显著（p>0.05），而各试验组内小鼠的个体体重差异明显。2.2 基因芯片检测结果图 2 水源水组与洁净水组受试小鼠的 14000 基因与基因芯片分子杂交散点图图 3 自来水组与与洁净水组受试小鼠的 14000 基因与基因芯片分子杂交散点图精品论文图 4 BaP 组与与洁净水组受试小鼠的 14000 基因与基因芯片分子杂交散点图图 2-4 散点图，分别水源水、自来水、阳性对照（BaP 组）与洁净水组受试小 鼠的 14000 个基因分子杂交信号的对数值。纵横坐标对数值的相应交汇点，称为 散点。散点图中，共有 8 条斜线。自上而下的第 4-5 条线之间，是两组小鼠基因转 录表达同处正常水平区域的散点区，是非中毒的基因区，简称中区。中区以上， 是纵坐标数值>横坐标数值的散点区，指示表达增强的基因；其中纵坐标数值/横坐 标数值2 的散点，是表达增强显著的基因。中区以下，是横坐标数值>纵坐标数值 的散点区，指示表达减弱的基因；其中横坐标数值/纵坐标数值2 的散点，是表达 减弱显著的基因。无论是纵坐标数值/横坐标数值2，还是横坐标数值/纵坐标数值2，均是判断基因表达中毒的阈值参数。归纳分析图 1图 3 的散点见表 1。 表 1. 水源水组、自来水组、BaP 组与洁净水组受试小鼠的散点统计比较表达增强散点表达减弱散点总差异表达散点总数强度2总数强度2总数强度2水源水组-洁净水组4961125461111042223自来水组-洁净水组3561449511991307343BaP 液组-洁净水组11371133001971437310基因表达中毒类型表 1 以阴性对照组（洁净水）为参考标准，分析长江水源水组、自来水组、BaP 组受试小鼠的基因转录表达异常状况。各组基因表达增强或减弱2 散点数的 排序规律：(A)表达增强2 顺序：自来水组（114）>BaP 液组（113）>水源水组（112）；(B)表达减弱2 顺序：自来水组（199）>BaP 液组（197）>水源水组（111）；(C)增强减弱2 顺序：自来水组（343）>BaP 液组（310）>水源水组（223）。 上述 3 种2 散点数排序一致，表明自来水对受试小鼠基因毒性>BaP 组>水源 水。自来水组基因毒性>水源水组基因毒性，可能是水源水虽然经过化学絮凝沉淀， 去除了大量的悬浮物，但是其中微量的 POPs 没有得到有效去除，进入了自来水。自来水比水源水洁净，但是微量 POPs 浓度并不显著降低，更利于促使小鼠基因中 毒。自来水组基因毒性>BaP 组基因毒性，则可能是长江水源 20 种 POPs 总浓度9.41g/L，远远高于 BaP 饱和浓度 3.8g/L，导致自来水组毒性高于 BaP 组毒性。 各组基因表达增强或减弱总数的排序规律：(A)表达增强散点总数：BaP 组（1137）>水源水组（496）>自来水组（356）；(B)表达减弱散点总数：自来水组（951）>水源水组（546）>BaP 组（300）； (C)增强减弱所有散点：BaP 组（1437）>自来水组（1307）>水源水组（1042）。 上述 3 种散点总数排序不一。BaP 组对基因表达增强的毒性处于首位，而对基因表达减弱的毒性处于末位。BaP 组中小鼠 14000 个基因表达异常的总数量最多， 但高强度差异表达（2）不及自来水。自来水中有毒有害物质对基因表达减弱的 毒性处于首位，而对基因表达增强的毒性处于末位，与 BaP 组结果正好相反。自 来水引起小鼠 14000 个基因表达异常的总数量处于中位，但高强度差异表达基因 数最高。对于水源水组，水源水中有毒有害物质对基因表达减弱或者表达增强的 毒性，均处于中间水平，但总差异表达数目处于末位。根据以上的分析可以看出，无论是高强度差异表达的散点总数还是总散点数， 水源水组均处末位，表明水源水对小鼠基因毒性的强度和数量，均低于其它 2 个 组。自来水高强度异常表达基因最高，但总的异常表达基因数低于 BaP 组。BaP 组小鼠高强度异常表达基因居中，而总的异常表达基因数最高。如果小鼠中毒时 间>3 个月，很可能 BaP 液中毒基因的数量和强度均会处于最前位置。2.3 基因毒性风险分析长江南京饮用水源 20 种 PAHs 总浓度达 9.41g/L，是中国GB 5749-2006极 限值 2g/L 的 4.7 倍；是世界卫生组织WHO,2006极限值 0.4g/L 的 23.5 倍。长江 饮用水源水经化学絮凝工艺处理生产自来水，去除 PAHs 的效率<10。所以长江 水源 PAHs 严重超标，势必导致南京自来水 PAHs 的严重超标。长江饮用水源中单项 BaP 达 0.029g/L，而 BaP 致癌控制浓度为 0.0029g/L。 长江水源 BaP 单项致癌风险指数 RQs 为 0.029/0.002910，表明长江水源仅就 BaP 的单项参数指标，已经存在相当的致癌风险。应用基因芯片检测基因毒性强度的顺序是：南京自来水>BaP 液>长江水源水。精品论文 BaP 化学液的致癌风险指数 RQs=(3.8g/L)/(0.0029g/L)1310。南京自来水基因 毒性强度>BaP 化学液，所以推论南京自来水 RQs>1310；南京自来水毒性来自于长江饮用水源，推理长江水源潜在致癌的毒性风险指数 RQs 也>1310，存在致癌风险。BaP 化学液毒性>长江水源水，可能是长江水源中其他污染物，屏蔽了基因毒 性。一旦经过化学絮凝处理之后，在自来水中释放出来，显示出南京自来水的毒 性>3.8g/L 的 BaP 化学溶液。3. 结语应用基因芯片，检测发现长江饮用水源及其生产的南京自来水，对小鼠的基 因转录表达存在分子毒性，潜在致癌风险系数 RQ>1310，存在严重的致癌风险。 BaP 是具有强致癌性的优先控制污染物，以 BaP 化学液的基因毒性作为参照，研 究结果具有可比性。参考文献1F. Wang, X.H. Xia, and Y.J. Sha, Distribution of Phthalic Acid Esters in Wuhan section of theYangtze River, China. J. Hazard. Mater. 154 (2008) 317-324.2M. Shen, Y.J. Yu, G.J. Zheng, H.X. Yu, P.K.S. Lam, J.F. Feng, and Z.B. Wei, Polychlorinated biphenyls and polybrominated diphenyl ethers in surface sediments from the Yangtze River Delta. Mar. Pollut. Bull. 52 (2006) 1299-1304.3C. Sun, Y. Dong, S. Xu, S. Yao, J. Dai, S. Han, and L. Wang, Trace analysis of dissolved polychlorinated organic compounds in the water of the Yangtse River (Nanjing, China). Environ.Pollut. 117 (2002) 9-14.4A.K. Kopec, D.R. Boverhof, L.D. Burgoon, D. Ibrahim-Aibo, J.R. Harkema, C. Tashiro, B.Chittim, and T.R. Zacharewski, Comparative toxicogenomic examination of the hepatic effects of PCB126 and TCDD in immature, ovariectomized C57BL/6 mice. Toxicological Sciences 102(2008) 61-75.5Y.H. Wei, Y. Liu, H.S. Wang, Y. Tao, and J.Y. 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Toxicology and Applied Pharmacology227 (2008) 400-416.Toxicities of Source Water and Tap Water on Gene Transcription for Mus musculus Detected with DNA MicroarrayWu Bing1, Zhang Yan1, Li Yiqiang2, Zhao Dayong1, Zhang Xuxiang1, Cheng Shupei1 (1.State Key Laboratory of Pollution Control & Resource Reuse and School of the Environment at Nanjing University, Nanjing, 210093; 2. Jiangsu Province Environmental Monitoring Centre, Nanjing,210036)AbstractTo assess the environmental and human health risks for source of drinking water and tap water, a toxicogenomic approach was applied to hepatic gene transcription profileanalysis for mouse (Mus musculus，KM) using a custom cDNA microarray (MouseGenome 430A 2.0) containing 14000 unique genes. Four groups of mice were fed with source water, drinking water, 3.8g/L benzoapyrene (BaP) solution and clean water for 90 days, respectively. The results showed that, comparing with gene expression of clean water group, the toxicity order of the 3 groups was drinking water > BaP > source water. The cancer risk quotients (RQs) for the BaP chemical solution in this study was1310. Since the genome toxicity of drinking water was higher than BaP in the order obtained in this research, it could be deduced that the RQs value for drinking water should be higher than 1310. In addition, the RQs for Yangtze River source water should be also higher than 1310, because the drinking water toxicity is from the source water directly. The data indicate that it is necessary to control and eliminate the environmental and human health risks from the source water and tap water to protect human health. Keywords: microarray, Yangtze River, source water, tap water, genotoxicity第一作者：吴兵，男，在读博士生，研究方向：环境生物技术及信息学，E-mail: wubing责任作者：程树培，男，教授，博导，研究方向：环境生物技术及信息学，E-mail: chensp- 7 -