曼氏无针乌贼缠卵腺组织学及分泌颗粒形成的超微.doc

精品论文曼氏无针乌贼缠卵腺组织学及分泌颗粒形成的超微结构1王津伟 1.2，王春琳 1.2，余红卫 1.21. 宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波（315211）2. 应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江宁波（315211）E-mail: wangjinwei709摘要: 采用组织学和电镜技术对曼氏无针乌贼的缠卵腺及其腺体细胞进行了研究。结果表明: 缠卵腺是由缠卵腺壁（包括外膜层及肌肉层）、分泌叶瓣两部分构成。分泌叶瓣由结缔 组织和两类细胞组成(型细胞和型细胞)，其中型细胞起分泌功能，其中以糖蛋白为主；型细胞没有分泌功能，可能对型细胞起支持作用。在型细胞中，分泌颗粒在高尔基体上合成后，分散在细胞质中，向细胞膜移动，最后细胞以胞吐的形式将糖蛋白释放到细胞外。 关键词: 曼氏无针乌贼；缠卵腺；组织学；分泌颗粒；超微结构中图分类号：S 917文献标识码：A头足类缠卵腺位于直肠两侧内脏囊壁上，墨囊的两侧，成卵状，白色，开口于外套腔， 其分泌物形成受精卵三级卵膜的一部分。缠卵腺在头足类中普遍存在，与头足类的生殖活动 密切相关1。国内外关于头足类缠卵腺的研究较少，此前一直认为缠卵腺只在雌性头足类中存在，但 是Hoving2等在研究中发现，在雄性的大洋鱿鱼(Ancistrocheirus lesueurii)中也存在着缠卵腺， 这可能与头足类的性转化有关，但在曼氏无针乌贼（Sepiella maindroni de Rochebrune）还没 有发现这种现象；Henry3等人曾经对神经系统影响缠卵腺的分泌物质进行过研究，发现几 种多肽对于缠卵腺物质的分泌有调节作用；对于头足类缠卵腺的形态学和组织学研究，仅 Lum-Kong4等曾做过福氏枪乌贼（Loligo forbesi）从幼体到成体缠卵腺 的组织切片，揭示了缠卵腺“书页状”腺体的构造。此外，对于缠卵腺分泌物质的研究， Yu5 等在柔鱼（Ommastrephid squid）的缠卵腺中发现一种特殊的糖蛋白（海洋粘蛋白），可用于 高保湿和皮肤保护的化妆品制作。Burr 6,7 等研究认为枪乌贼的缠卵腺中还有一种抑制纤毛 运动的因子，可以抑制纤毛的摆动。目前，国内外还未见曼氏无针乌贼缠卵腺组织学及其分 泌物质分泌过程的报道。本文研究了曼氏无针乌贼缠卵腺的组织结构及其分泌颗粒形成的超 微结构，旨为进一步揭示头足类副性腺在繁殖中的作用。1. 材料和方法1.1 材料实验所用12只活体雌性曼氏无针乌贼于2008年4月间取自福建霞浦养殖场,平均胴长2.5-3.5cm ,体长10.0-12.0cm。1.2 方法1.2.1 石蜡切片样品的制备 取缠卵腺一部分，用波恩氏液固定,常规程序脱水、透明、石蜡包埋，切片，厚度5µm，1本课题得到国家自然科学基金(No.40646030) 、国家教育部长江学者和创新团队发展计划(No.IRT0734) 、 教育部重点科研项目(No.207045) 、浙江省重大科技专项(No.2006C13040)、宁波大学科研基金（xk613042） 的资助。- 7 -Harris苏木精-伊红染色(HE)。除此之外，还利用PAS反应对分泌颗粒进行染色8。1.2.2 透射电镜样品的制备取缠卵腺一部分，大小在0.5-1mm3之间，用4的2.5%戊二醛固定24h，再经4的1%四 氧化锇固定1h，2.5%戊二醛和1%四氧化锇都由pH7.4的0.1molPL磷酸缓冲液配制，双固定后 经0.1molPL磷酸缓冲液漂洗，梯度酒精脱水，Epon812环氧树脂包埋， LKB28800超薄切片 机切片,切片厚度约90nm。切片后经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色, HitachiH-7650透射电子显微 镜观察并拍照，拍照时电压80kV。2. 结果2.1 缠卵腺结构曼氏无针乌贼缠卵腺为一对，呈椭圆形，位于直肠两侧内脏囊壁上、墨囊的两侧，分别 有导管在墨囊导管的两侧并行开口于外套腔。整个腺体由缠卵腺壁（外膜层及肌肉连接组织） 分泌叶瓣两部分组成。2.1.1 缠卵腺壁 缠卵腺壁由外膜层和肌肉层两部分组成。外膜层由单层柱状上皮细胞组成。肌层为平滑肌，约为4-5层，主要为环肌。纵肌肌纤维的纵切面呈长梭形，细胞界限不清楚；细胞核呈球状或杆状。结缔组织位于最里层，所有分泌叶瓣的末端均联结在结缔组织上。（图版：1-4）2.1.2 分泌叶瓣 缠卵腺的分泌叶瓣扁平状，平行排列，各个叶片折叠后联结在缠卵腺壁的结缔组织上，向内延伸到腺体内腔，类似装订的书页，从切片上看，叶瓣的长短不一，有的呈现一定角度的弯曲。叶瓣的外围着生纤毛，较致密。（图版：2）电镜下, 缠卵腺分泌的颗粒游离地存在于腺体细胞的细胞质中,呈包成囊泡状。电镜下很 难观察出分泌颗粒的内部构造。（图版：3,4）PAS反应显示出，缠卵腺中含有较多的糖原颗粒，由型细胞分泌，释放到细胞外。（图 版：4）2.2 缠卵腺细胞类型和分泌颗粒形成的超微结构2.2.1缠卵腺细胞的类型 缠卵腺各叶瓣中间为结缔组织，联结在结缔组织上有两种不同类型的细胞，型细胞和型细胞。型细胞位于分泌叶瓣的内部，紧密排列；型细胞位于分泌叶瓣的外部，与型细胞连接紧密。型细胞有一个大的(4-8µm) 圆形细胞核和密度均一的细胞质（图版：1），胞质内线粒体和高尔基体较发达，内有分泌的小颗粒物质（图版：3），此外，细胞外 表面纤毛发达，主要生长在膜上部分区域（图版：3）；型细胞数量较少,细胞核小,位于 细胞中部, 大部分呈椭圆状。胞质内细胞器较少，内无明显的颗粒物分泌（图版：2）。详 见表1。细胞形状Cell shape核仁Nucleolus核质比表1 两种不同类型的缠卵腺细胞Table 1 Two different kinds of cells in the nidamental gland型细胞 Type cell 不规则irregular一个One大型细胞 Type cell 高柱状Columnar一个One小Nucleus/cytoplasm ratio线粒体Mitochondriabig丰富MuchSmall较少Less高尔基体GC分泌颗粒Secretory granule丰富Much有Much较少Less无None纤毛Cilla有Much无None2.2.2 缠卵腺颗粒形成的超微结构电镜下观察到型细胞中存在着小的颗粒囊泡，在高尔基体上形成（图版：4），分散 于细胞质中，颜色较浅，部分囊泡向胞膜移动，囊泡于细胞膜融合后细胞膜向外突出（图版 ：5），最终将颗粒释放到细胞外（图版：6）。颗粒的分泌部位主要集中于型细胞的无 纤毛区域。而纤毛发达区域分泌的颗粒较少。3. 讨论3.1“书页状”腺体A.Lum-Kong4等在研究福氏枪乌贼（Loligo forbesi）时发现，福氏枪乌贼的缠卵腺呈 现一种“书页状”结构，通过对曼氏无针乌贼缠卵腺的组织结构观察，其腺体也呈现一种“书 页状”结构，这种“书页状”腺体比较罕见，整个腺体由许多平行分泌叶瓣组成，有的呈折叠 弯曲状，叶瓣中的型细胞分泌的分泌物被排放到腺体内部，由导管排出。这种腺体结构充 分地利用了腺体的空间体积，增大了分泌面积。腺体的中部为结缔组织，内部充满了毛细血 管，可以为腺体细胞提供营养。丰富的分泌细胞的存在以及发达结缔组织和毛细血管,说明 缠卵腺是一种典型的分泌腺体。但是缠卵腺壁的肌肉层并不是很发达，不能象墨囊一样将分 泌的墨汁喷出10，而是在肌肉层的持续缓慢的挤压下排出。3.2 缠卵腺细胞的类型乌贼的缠卵腺有两类上皮细胞：一类是具有分泌功能的不规则的型细胞，细胞核发达， 内含有分泌颗粒，型细胞靠近管道内壁的一侧生有纤毛，但在有颗粒分泌区域纤毛稀少， 可能与其分泌功能有关，纤毛的摆动带动颗粒物质运出管道；另一类型细胞位于型细胞 的内部，呈长柱状，细胞核不发达，型细胞紧密连接在型细胞上，推测型细胞对于 型细胞起支持作用。3.3 缠卵腺粘性糖蛋白的形成和分泌目前，对于缠卵腺分泌颗粒的研究还没有具体的报道，但研究缠卵腺的营养组成发现缠 卵腺中蛋白质和糖类的含量丰富，Yu 5研究了缠卵腺分泌物的性质，初步鉴定为一种粘性蛋 白。本文对缠卵腺的分泌物进行了PAS反应的实验，从一定程度上初步证明主要分泌物为糖 蛋白。此外，由于动物细胞中蛋白质都是在核糖体上合成，然后进入高尔基复合体中进行糖 基化修饰9，所以型细胞中发达的高尔基体和核糖体也证明了缠卵腺主要分泌糖蛋白。对于颗粒的分泌过程，国内外还没有相关的研究，本实验观察到分泌颗粒由高尔基体加 工好后由囊泡包裹，合成到胞质中，随后向细胞膜方向移动，最后囊泡膜与细胞膜融合并形 成膜的一部分，释放出粘性糖蛋白。此外在型细胞中发现存在大量的线粒体，结合观察到 的管道内表面纤毛，推测其为纤毛的运动提供能量，从而运输分泌的糖蛋白。Burr6,7提取 了缠卵腺内的分泌物，发现其中含有可以抑制纤毛活动的物质，这可能与控制缠卵腺物质的 分泌有关，当未产卵时，纤毛不摆动，同时也没有粘性糖蛋白生成4；在产卵时，纤毛摆动， 推动粘性糖蛋白进入导管并覆盖带卵上，完成后，缠卵腺分泌一种因子抑制纤毛摆动，缠卵 腺停止分泌蛋白到卵上，这说明乌贼三级卵膜的形成是一个严格的调节控制过程。此外，有 可以抑制纤毛摆动的物质分泌在卵膜上也可以阻止带有纤毛的捕食者6,7。本实验观察到分 泌的颗粒可能包含这上述因子，但还要进行进一步的证实。参考文献1 刘凌云,普通动物学M.北京:高等教育出版社,1997（2004重印）,227-2282 Hoving,H.J.T., Nidamental glands in males of the oceanic squid Ancistrocheirus lesueurii (Cephalopoda: Ancistrocheiridae)-sex change or intersexuality? J .Journal of Zoology, 2006 ,369(3):341-3483 Henry J. Peptidergic control of egg-laying in the cephalopod Sepia officinalis involvement of FMRF amide and FMRF amide-related peptides J.Peptides,1999, 20:1061-10704Lum-Kong.AAhistologicalstudyoftheaccessoryreproductiveorgansoffemaleLoligoforbesi(Cephalopoda:Loliginidae)J. Zoology, 1992 ,226:469-4905 ASO YU,Development and application of marine mucin for cosmetics. J.Fragr ,2006,34(3):14-20.6 Burr G.Squid Nidamental Gland Extract:Isolation of a Factor Inhibiting Cillary ActivityJ.ExperimentalZoology,1973,184:335-340.7 Burr G,Atkinson.A ciliary activity inhibitor extracted from the nidamental gland of Loligo pealei. BIOLOGICAL BULLETIN, 1968, 135 (2): 413-&,8 Pearse A.Histochemistry,Thoeretical and Applied London.Churchill Livingsone ,1983,1557-1565 9 翟中和.细胞生物学M.北京:高等教育出版社,2000（2003 重印）,164-205 10樊晓旭.曼氏无针乌贼墨囊组织学及墨汁形成的超微结构J.动物学报,2008,54 (2) :366 - 372Histology of the nidamental gland of cuttlefish （Sepiella maindroni ）and ultrastructure ofsecretory granuleformationWANG Jin-wei1.2, WANG Chun-lin1.2, YU Hong-wei1.21. Ningbo University , Faculty of Life Science and Biotechnology , Ningbo (315211)2. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education , Ningbo (315211)AbstractThe histology and ultrastructure of the nidamental gland of Sepiella maindroni de Rochebrune werestudied using light and electron microscopy. Results indicated that the nidmental gland of Sepiella maindron consisted of two parts : an nidamental wall and many lamellae; the lamellae are consisted ofconnective tissue and two types of cells(Typecells and typecells) , Typecells engaged the mainfunction of secreting ,most of the secretory granule were glucoprotein which disperse in the cytoplasm and be released with exocytosit; Typecells can not secrete granule and maybe have a function of supporting the typecells .Keywords: Sepiella maindroni deRochebrune; nidamental gland; Histology; Ultrastructure作者简介：王津伟（1982-），男，山东威海人，硕士研究生，主要从事水产经济动物苗种繁 育研究。图版IPlateI1.缠卵腺纵切面 H.E×1002.缠卵腺横切面 H.E×1003.分泌叶瓣及纤毛 H.E×2004.叶瓣分泌颗粒 PAS×200OL:外膜层；ML:肌肉层；CT:结缔组织；La:小瓣；IlS:瓣间区；CI:纤毛；GP:糖蛋白颗粒。Plate I1.Vertical section of the wall of nidamental gland H.E×1002.Transverse section of the nidamental gland H.E×1003.Lamella and the cilla H.E×2004.Glycoprote In partials excreting from the lamella PAS×200OL:Outer layer. ML：Muscle layer. CT：Connective tissue. La：Lamella.IlS ：Interlamellar space.CI：Cilla.GP：Glycoprotein partical.图版Plate图版1.I型细胞×50002. 型细胞×50003.I型细胞胞质内细胞器×300004.I型细胞高尔基体分泌颗粒×400005.分泌颗粒向细胞膜运输×300006.分泌颗粒突出细胞膜并释放到膜外×30000N:细胞核。CI:纤毛。MI:线粒体。GC:高尔基复合体。SG:分泌颗粒。CR:纤毛根部。GP:糖蛋白颗粒。Plate1Type cell I×50002Type cell ×50003Organelles In the Type cell I×300004The Golgi complex of Type cell I is secreting the particals ×400005The secretory granules are moving to the membrane ×300006The secretory granules are excreting to the extra cell ×30000N:Nuclear.CI：Cilla.MI：Mitochondria.GC：Golgi complex.SG：Secretory granule.CR：Cilla root.GP：Glycoproteinpartical.