SRAP、TRAP、SSR、ISSR 分子标记在水.doc

精品论文SRAP、TRAP、SSR、ISSR 分子标记在水稻籼粳分 型中的系统学研究5戴小军（湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙，410081）摘要：利用 SRAP、TRAP 新型分子标记，并结合 SSR、ISSR 标记对水稻 47 个材料进行了遗传多样性分析，四种分子标记多态性 ISSR>SRAP>SSR>TRAP，SRAP 标记的平均遗传相10似性为 0.70, TRAP 标记 0.74,SSR 标记 0.75,ISSR 标记 0.85；四种分子标记之间都呈极显著 相关；聚类分析中籼粳稻都有较好的区分，在部分材料归类上有部分差异，但 SRAP 和 TRAP 较 SSR 和 ISSR 准确，而合并四种分子标记并聚类分析得到的树状图更能反映真正的 系统演化关系。实验结果表明 SRAP 和 TRAP 标记在水稻研究都有较好的利用价值，SRAP 标记在区分亲缘关系较 近的品种间有更 强的分 辨能力。四种分子标记 中爪哇稻 15Lemont,POO2 都归为籼类群,说明它们与籼稻更近的亲缘关系。而普通野生稻材料在不同分 子标记的树状图中，部分材料在籼粳归类上存在差异，在合并四种标记聚类分析中，所有 野生稻材料都归为粳稻一类群，表明中国普通稻仍以偏粳为主。 关键词：水稻；SSR；ISSR；SRAP；TRAP；聚类分析中图分类号：S332.220Molecular Phylogenetic Research on Classification of Indica and Japonica rice using SRAP, TRAP, SSR, ISSR markersDai Xiaojun(College of Life Science HuNan Normal University, ChangSha, HuNan, 410081, China)25Abstract: Rice (Oryza sativa L.) is an important food crop, which is a constituent of more than 50% of the different varieties of food preparations in China. In order to exploit the utilization of heterosisbetween rice subspecies, 47 varieties of rice were classified into indica and japonica types firstly, usingsequence-related amplified polymorphism (SRAP) and target region amplification polymorphism(TRAP) markers and then simple sequence repeat (SSR) and inter simple sequence repeat (ISSR)30markers. Based on differences in the level of polymorphisms detected by the 4 markersSRAP > ISSR> SSR >TRAP. The average genetic similarity of SRAP is 0.70, TRAP is 0.74, SSR 0.75, ISSR 0.85. which showed highly significant correlation between different markers.The subspecies could be differentiated by cluster analysis while some plants were different in 4 Phylogenetic trees. The result indicated that SRAP and TRAP have potential application in rice research and SRAP has more35differentiated ability between varieties that had a near relationship.The javanica rice Lemont and P002were belong to indica clade. Some wild rice varieties characterized as indica-like or japonica-like in cluster analysis with different markers; however, the cluster analysis of the data sets of the 4 markers combined , all the wild rice varieties were characterized as japonica-like. This indicated that the indica japonica differentiation of Chinese common wild rice varieties were not completed though the40japonica-like tendency was happened. )基金项目：教育部博士点教师基金资助项目(20094306120005)作者简介：戴小军(1976-), 男, 湖南张家界人,讲师, 主要从事植物发育与分子生物学. E-mail:hello_dxj- 7 -Key words: Oryza sativa L; SSR; ISSR; SRAP; TRAP; Cluster analysis0引言籼粳稻亚种间杂种优势的利用是杂交稻育种的发展方向之一，而了解种质资源多样性及 亲缘关系是育种工作的基础。RAPD、AFLP、RFLP、SSR、ISSR 等分子标记技术在检测遗45传差异上有较高的灵敏度，已在水稻遗传多样性分析、种质鉴定、DNA 图谱构建以及标记辅助选择等方面有广泛应用1-4。SRAP( Sequence related Amplified Polymorphism)和 TRAP(target region amplified polymorphism)分子标记是两种新型分子标记系统.SRAP 标记针对基因外显子里 GC 含量丰 富而启动子、内含子里 AT 含量丰富的特点来设计引物进行扩增，而 TRAP 技术是基于已知50的固定引物与 SRAP 所用的任意引物组合而成。这两种标记已经应用于作物种质资源及生 物多样性分析中，图谱构建、比较基因组学、遗传多样性分析5-7，尤其在寻找作物重要农 艺性状分子标记方面有很高的应用价值8-11。SSR、ISSR 分子标记在水稻遗传多样性，籼粳分类等方面进行了大量的研究，但也存 在不足，SRAP 和 TRAP 两种分子标记技术能否较好的对水稻籼粳材料进行分析，他们与55SSR,ISSR 相比，各自有什么特点。本实验以 47 份典型籼粳稻、两系、三系不育系、恢复系 以及野生稻为研究对象，运用 SSR、ISSR、SRAP、TRAP 分子标记对其进行了研究，旨在 深入广泛地探讨水稻的遗传多态性，为水稻遗传育种提供理论指导。1材料与方法1.1 材料60供试材料包括 7 份光温敏核不育系，4 份三系不育系，8 份不同地域普通野生稻，以及28 份不同生态型的品种（表 1）。表1 供试材料及来源Table 1 Plant materials used in the present study编号NO.名称varieties来源Origin籼粳类型Species and编号NO.名称varieties来源Origin籼粳类型Species andTypeType1南京11号中国籼25准S中国籼Nanjing11ChinaindicaZhunSChinaindica2广陆矮四号中国籼261103S中国籼guangluai4 aChinaindicaChinaindica39311中国籼27培矮64S中国籼ChinaindicaPeiai64SChinaindica4明恢63中国籼287001S中国粳Minghui63ChinaindicaChinaJaponia5R288中国籼29农垦58S中国粳ChinaindicaChinaJaponia6湛122中国籼30秋光日本粳Zhan122 aChinaindicaAkihikaliJapanJaponia7R402中国籼31日本晴日本粳ChinaindicaNipponbareJapanJaponia8丰华占中国籼32122中国粳FenghuazhanChinaindicaChinaJaponia9余赤231-8中国籼33百日早中国粳Yuchi231-8ChinaindicaBairizaoChinaJaponia10蜀恢257中国籼34矮子糯中国粳Shuhui257 aChinaindicaAizinuoChinaJaponia11株118中国籼35空育131日本粳12Zhu1180密阳46China韩国indica籼36Kongyu131沈农265Japan中国Japonia粳Nanjing3 aChinaindicaShennong265ChinaJaponia13早籼24中国籼37超高产1号中国粳Zaoxian24ChinaindicaChaogaochan1ChinaJaponia14湘早优32中国籼38Lemont美国爪哇Xiangzaoyou32ChinaindicaUSAjavanica15美香占2号中国籼39P002美国爪哇Meixiangzhan2ChinaindicaUSAjavanica16青珍中国籼40东乡野生稻中国野生Qingzhen aChinaindicaDongxiangChinao.rffipogon17晚恢110中国籼41高洲野生稻中国野生Wanhui110ChinaindicaGaozhouChinao.rufipogon18巴西陆稻巴西陆稻42桂林野生稻中国野生Brazil upland riceBrazilUplandriceGuilinChinao.rufipogon19珍汕97A中国籼43江永野生稻中国野生Zhenshan97AChinaindicaJiangyongChinao.rufipogon20冈46A中国籼44安仁野生稻中国野生Gang46AChinaindicaAnrenChinao.rufipogon21T98A中国籼45柳洲野生稻中国野生ChinaindicaLiuzhouChinao.rufipogon22V20A中国籼46海南野生稻中国野生ChinaindicaHainanChinao.rufipogon23D38S中国籼47茶陵野生稻中国野生ChinaindicaChalingChinao.rufipogon24株1S中国籼Zhu1SChinaindica651.2 方法1.2.1DNA 提取运用 CTAB 法从水稻鲜叶中提取 DNA1.2.2引物筛选及其检测70SSR 引物序列来自网上资料(http:/www.gramene.org/),经筛选的 33 对 SSR 引物均匀分布 于 112 号染色体上,包括 SSR 和 EST-SSR 引物。SSR 扩增反应程序为:94预变性 5min;94变性 1min,5567(具体温度由引物的特异序列决定)退火 1min,72延伸 2 min,30 个循 环;最后再是 72延伸 10min,4保存备用。ISSR 引物由加拿大哥伦比亚大学（UBC）提供。ISSR - PCR 反应体系和扩增程序同文75献(李进波等, 2002)。SRAP 所选引物序列参考 Li 的文献。扩增程序: 前 5 个循环为 94变性 1 min, 35复 性 1 min, 72延伸 1 min 30 s, 后 30 个循环仅将复性温度升为 50。最后 72延伸 10 min。TRAP 的 PCR 反应采用 25l 的反应体系,引物选择 SRAP 中的随机引物和 SSR、EST-SSR 中的固定引物。PCR 扩增程序是 94 变性 5min ;然后开始 5 个循环(94 变性8045s ,38退火 45s ,72 延伸 lmin) ;再进行 35 个循环(94变性 45s ,55退火 45s ,72延伸l min) ;最后 72 延伸 10min。1.3 数据处理与分析扩增产物经扩增产物在 2%琼脂糖凝胶电泳检测。分离后，对每一个样品的某个条带出 现与否分别给予“1”，“0”记录，然后用 UPGMA 法（unweighted pair-group method with85arithmetic mean,算术平均非加权配组法）分别进行聚类分析，并绘制树状图。2结果与分析2.1 引物筛选及分子标记多态性分析90951002.1.1不同分子标记在典型籼稻、粳稻分型中的应用比较根据本实验室和前人的研究结果，选择了 33 对扩增效果好，分布于 12 条染色体上的基 因组 SSR 引物对 47 个供试材料进行了研究，共检测到了 114 条清晰的多态性带，不同引物 扩增的多态性带数在 1-7 之间，平均每个基因座有等位基因 3.5 个。其中典型籼粳稻之间有78 条多态性带，籼粳亚种间特异性带 13 条，占 16.7%。从 ISSR 引物中共筛选到 28 对进行检测，共检测到 160 个多态性片段。不同引物扩增 的多态性带数在 3-8 之间，平均每对引物扩增 4.0 个多态性片段。典型籼粳亚种间有 91 条 多态性带，18 条带具有籼粳特异性差异,占 19.8%在 120 对 SRAP 引物中筛选到 29 对多态性比较丰富的引物用于研究，共检测到 128 条 多态性片段，不同引物扩增的多态性带数在 2-9 之间，平均每对引物扩增 4.4 个多态性片段。 典型籼粳亚种间有 97 条多态性带，其中 25 条带具有籼粳特异性差异，占 25.8%。表2 四种分子标记分子标记扩增结果比较Table 2 Comparison of PCR results among 4 molecular markersSRAPTRAPSSRISSRSRAPTRAP-0.860-SSR0.7870.770-ISSR0.7940.7720.793-1052.2 供试材料的遗传相似性分析对扩增结果采用 Nei 遗传相似性系数(NS)的计算方法,得到四种标记扩增结果的相似性 系数矩阵。结果表明，四种分子标记中相对而言,SRAP 和 SSR 能检测到较大的遗传变异， 而 SRAP 标记的平均相似性最小，即平均遗传距离最大，从而有更强的分辨能力，TRAP 和 SSR 所得到的平均遗传相似性差不多，ISSR 的相似性最高。110遗传相似系数 Genetic similarities平均遗传相似系数Mean genetic similarities表3 四种分子标记遗传相似系数比较Table 3 Comparison of genetic similarities among 4 molecular markersSRAP TRAP SSR ISSR0.46-0.94 0.55-0.94 0.50-1.00 0.69-1.000.70 0.74 0.75 0.852.3 SSR、ISSR、SRAP、TRAP 聚类分析1152.3.1利用四种不同分子标记构建的树状图对不同分子标记，分别计算出标准距离，用 UPGMA 法进行聚类分析并绘制树状图。 在 利用 SSR 标记构建的树状图中（图 1）,供试材料可分为籼亚群和粳亚群，在籼亚群中， 两 系、三系不育材料都位于同一分支，表现出较近的亲缘关系；巴西陆稻，爪哇稻 Lemont， P002 也在籼亚群内，但与籼稻存在一定遗传距离，海南野生稻和茶陵野生稻偏籼。粳亚群 中，所有粳型材料位于同一分支,而另 6 个野生稻材料位于另一分支。120125130135在利用 ISSR 构建的树状图中（图 2），籼粳材料各位于不同类群，籼亚群中，不育系中培矮 64S 因含有明显的粳型血缘而与其他籼型材料有一定的距离外，其他不育系材料都处 于同一分支；爪哇稻以及安仁野生稻，柳洲野生稻，海南野生稻聚类分析中归为籼类群。粳 亚群中，所有粳稻材料位于同一分支，东乡野生稻，高洲野生稻，桂林野生稻，江永野生稻 位于另一分支，巴西陆稻与粳稻有更近的亲缘关系。在利用 SRAP 构建的树状图中(图 3)，籼粳亚种都有较好的区分,籼分支中,不育系材料除 培矮 64S 遗传距离较远处,都处于同一分支,爪哇稻和安仁野生稻位于籼亚群;粳分支中,野生 稻材料与粳稻各形成不同分支,表现出一定的遗传距离。在利用 TRAP 构建的树状图中(图 4)，籼粳亚种也能较好的区分，籼亚群中有两个分支， 爪哇稻及安仁野生稻归为籼类，而巴西陆稻和其余野生稻都与粳稻有更近的亲缘关系。但对 不同籼粳品种，聚类分析与其他分子标记都存在差异。图1 47个材料的SSR聚类分析注：1-47分别对应表1中不同供试材料，以下同。Fig.1 UPGMA dendrogram of 47 accessions of plant materials revealed by SSRNote: the numbers 147 correspond with the codes for the material in Table 1, the same bellowed图2 47个材料ISSR聚类分析Fig.2 UPGMA dendrogram of 47 accessions of plant materials revealed by ISSR140图3 47个材料SRAP聚类分析Fig.3 UPGMA dendrogram of 47 accessions of plant materials revealed by SRAP145150155图 4 47个材料TRAP聚类分析Fig.4 UPGMA dendrogram of 47 accessions of plant materials revealed by TRAP2.3.2结合 SSR、ISSR、SRAP、TRAP 分子标记构建的树状图图5 四种分子标记结合在一起的聚类分析Fig 5 UPGMA dendrogram of 47 accessions of plant materials revealed by combined data sets of the four individual molecular markers将四种分子标记检测的多态位点全部结合在一起，根据所得的遗传距离用 UPGMA 进 行聚类分析，并绘制树状图（图 5）。聚类结果表明，47 材料被分为籼粳两大类群，其中 8- 9 -160165个野生稻材料都归为了一亚群，并与粳稻有较近的亲缘关系；粳型材料中，不育系 7001S和农垦 58S 在同一分支，巴西陆稻与粳稻位于同一类群；籼类群中，两个含粳型血缘的材料 D38S 和培矮 64S 与籼稻表现出较远的亲缘关系，4 个三系不育材料聚为一类，5 个籼型两 系不育系也表现出较近的亲缘关系,聚类分析结果更与农艺性状相吻合。2.4 四种分子标记的相关性分析对四种分子标记的相似性系数矩阵进行相关性分析，表明四种标记之间都呈显著相关， 其中 SRAP 与 TRAP 的相关系数最高，为 0.86，其他几种分子标记相关性也都在 0.77-0.794 之间，从而进一步验证了四种标记聚类结果的相似性。表 4 SSR、ISSR、SRAP、TRAP分子标记相关性比较Table 4 comparison of correlation among 4 molecular markersSRAPTRAPSSRISSRSRAPTRAP-0.860-SSR0.7870.770-ISSR0.7940.7720.793-注： P<0.0011701751801851903结论SRAP 和 TRAP 分子常与其他分子标记结合被用于遗传分析。Ahmad 12等用 SSR 和 SRAP 标记对桃品种的遗传多样性进行了分析,发现 SRAP 标记能与 SSR 标记一样将遗传关 系很近的桃品种区分开来,而且 SRAP 标记比 SSR 标记更有效,快捷,成本低。Ferriol13等用 SRAP 标记和 AFLP 标记对西葫芦和笋瓜的遗传多样性进行了分析,认为 SRAP 标记结果与 AFLP 结果一致,而且 SRAP 标记比 AFLP 标记所提供的信息更接近于农艺性状的差异和历史 演变的结果。金梦阳14用 SRAP 技术，并结合 SSR、AFLP、TRAP 四种分子标记构建了甘 蓝型油菜的遗传图谱,表明 SRAP 是良好的分子标记系统, 同时用 SRAP 标记得到 7 个与含油 量有关,4 个与皮壳率相关的 QTL15。本研究以 SRAP 和 TRAP 标记系统，并结合 SSR 和 ISSR 标记对水稻进行聚类分析。结果表明 SRAP、TRAP 标记在实验操作过程扩增谱带清晰，结 果稳定，可较好应用于水稻系统学分析。四种分子标记都呈极显著相关，表明四种标记较高的相似性。多态性 SRAP>ISSR> SSR>TRAP, SRAP 标记扩增多态性最高,平均遗传相似性最小,在水稻中有更强的分辨能力, 能区分亲缘较近的品种，TRAP 虽多态性低于 ISSR 和 SRAP, 但稍高于 SSR, SSR 扩增的片 段长度一般在 100-300bp 之间，而 TRAP 扩增出来的片段在 50-1000bp 之间,其检测的是水稻 染色体上更多的碱基位点,且 SSR 检测的是重复片段长度的差异，而 TRAP 是 cDNA 上单碱 基的差异，且 TRA 扩增位置在 cDNA 上，一端为固定引物，较 SRAP,ISSR 更容易基因定位， 在水稻中具有较好应用潜力。四种分子标记中栽培稻籼粳亚种, 爪哇稻, 部分野生稻都有较好聚类, 一些亲缘关系近 的品种仍在聚类分析中都归为一支,如明恢 63 和 R288,9311 和南京 11 号等。但栽培稻许多 品种在不同标记中亲缘关系存着差异,巴西陆稻, 海南野生稻, 茶陵野生稻及安仁野生稻在 不同分子标记中聚类分析也不相同, 这也许正与它们检测的位点特性有关。从而说明利用单 个分子标记在对水稻精确归类时有一定的局限性。而将四种分子标记结合起来进行籼粳分 型，结果表明不仅提高了分辨率，而且排除了个别基因片段的干扰，从而更能反映真正的系 统演化关系。爪哇稻是籼,粳分化不太彻底的原始栽培稻,有关将爪哇稻归为栽培稻一亚种还是归为粳195200205亚种的一个生态类群一直存在争论16。王象坤,孙传清, 程侃声等17-18都支持将爪哇稻做为 粳亚种的一个生态类群。本研究在四种分子标记对爪哇稻的分析中表明构建的聚类图中,爪 哇稻也归为籼稻类群，由此推测爪哇稻应归为哪个亚种还需要做进一步研究。亚洲栽培稻起源于普通野生稻，普通野生稻的籼粳分化一直是研究热点，Morishima19 通过同工酶和形态性状分析，认为大多数普野介于典型籼稻和粳稻之间，中国普野主要偏粳 和籼粳中间型，南亚偏籼；Wang20 研究表明，中国普野偏籼和偏粳都有；本研究供试普通野生稻材料在不同分子标记野生稻中检测到栽培稻所不具备的许多新基因，可见中国普通野 生稻有丰富的遗传多样性，在水稻育种中有极大的应用潜力。聚类分析的树状图中，安仁, 柳洲,海南,茶陵野生稻在籼粳归类上存在差异，表明中国普通野生稻与籼粳稻复杂的亲缘关 系，但在合并了四种标记的聚类分析中，野生稻材料都与粳稻归为一类，中国普通稻仍以偏 粳为主。参考文献 (References)2102152202252302352402452501 Blair MW, Panaud O, McCouch SR,et al.Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice (Oryza sativa L)J. 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