TRPC6 在高糖所致足细胞骨架 Factin 损伤.doc

精品论文TRPC6 在高糖所致足细胞骨架 F-actin 损伤中的作用杨贺，赵波，孟可欣，徐佳，廖畅，焦军东5（哈尔滨医科大学附属第二医院肾内科，哈尔滨 150086）摘要：目的 探讨瞬时受体电位阳离子通道 6（Transient receptor potential channel 6， TRPC6) 在高糖诱导的肾小球足细胞骨架纤维状肌动蛋白（F-actin）损伤中的作用。方法 以条件永 生性人类肾小球足细胞为研究对象，分别采用 Real-time PCR，Western-blot 印迹技术观察高 糖条件下足细胞 TRPC6mRNA 和蛋白表达的变化,通过激光共聚焦法观察高糖作用下足细胞10细胞内钙的变化，以及利用激光共聚焦检测技术观察高糖条件下足细胞 F-actin 变化。结果 Real-time PCR 和 Western-blot 实验显示高糖作用下足细胞 TRPC6 通道蛋白 mRNA 和蛋白表 达明显上调；共聚焦数据数据显示，高糖作用下足细胞内钙明显增多，高糖条件下足细胞F-actin 出现重构，使用 TRPC6 抑制剂后有所恢复。结论 高糖诱导足细胞细胞骨架 F-actin发生损伤，且 TRPC6 参与高糖所致的足细胞骨架 F-actin 损伤。15关键词：糖尿病肾病；TRPC6；高糖；肾小球足细胞中图分类号：R587The role of TRPC6 in high glucose-induced podocytesF-actin injury20YANG He, ZHAO Bo, MENG Ke Xin, XU Jia, LIAO Chang, JIAO Jun Dong(Department of Nephrology,The Second Affiliated Hospital ,Harbin Medical University, Harbin 150086)Abstract: Objective To investigate the role of TRPC6（Transient receptor potential channel 6) inglomerular podocytes F-actin injury induced by high glucose. Methods The conditionally25immortalized human glomerular podocytes were cultured and the injury was induced by high glucose. Using Real-time PCR,Western-blot and Laser scanning confocal microscope to detect the alteration of TRPC6 mRNA,TRPC6 protein, calcium influx and podocytes F-actin under high glucose, respectively. Results After high glucose stimulation, the mRNA,protein of TRPC6 and calcium influx were up-regulated significantly, Laser scanning confocal microscope experiments30indicates that high glucose induced podocytes F-actin reorganization which recovered in part after using TRPC6 inhibitor; Conclusion TRPC6 is involved in high glucose-induced podocytes F-actin injury.Keywords: Diabetic nephropathy; TRPC6; High glucose; Glomerular podocytes350引言糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN)是糖尿病严重的并发症，发病率逐年增加，在终 末肾病中所占比例越来越大。关于糖尿病肾病发病机制，人们早期关注的是肾小球基质堆积， 基底膜增厚，肾小球硬化，肾间质纤维化等，然而这仅能解释部分蛋白排泄率和肾小球滤过 率的变化1。近年来研究表明，作为肾小球滤过屏障成分的足细胞在糖尿病肾病发生发展中40起到关键作用2-3。瞬时受体电位阳离子通道 6（TRPC6）是瞬时受体电位阳离子通道（TRPC）家族中的 一员，是一种非选择性的阳离子通道,在人体各组织、器官和细胞中均有表达。2005 年，Winn基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20092307110008）作者简介：杨贺，（1983-），女，博士研究生 离子通道与肾脏病。通信联系人：焦军东，（1968-），男，教授，离子通道与肾脏病。E-mail: jiaojundong- 6 -等4首次报道 TRPC6 基因突变导致局灶节段性肾小球硬化 ( focal segmental glomeruloscl erosis, FSGS), 从而揭示了 TRPC 通道,尤其 TRPC6 与肾脏疾病的密切关系。最近研究发现45TRPC6 与足细胞骨架之间也存在联系，体外培养的足细胞 TRPC6 高表达则可以引起 F-actin 解聚和重新分布，但是关于 TRPC6 与高糖所致的足细胞损伤的研究，目前报道较少。本实 验以体外培养的人肾小球足细胞为研究对象，探讨 TRPC6 在高糖条件下致足细胞 F-actin 损 伤中的作用。1材料与方法501.1 材料RPMI1640 培养基(Hyclone,USA),高容量 cDNA 反转录试剂盒（ABI Applied Biosystems, USA），TRPC6 抗体（Alomone Labs,Israel),Fluo-3AM(Molecular probes Eugere OR,USA)， Thapsigargin(TG),1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol(OAG),FITC-phalloidin,2-aminoethoxydiphenylborane(2APB)均购自 Sigma-Aldrieh 公司（st.Louis,MO,USA）。551.2 方法1.2.1细胞培养和分组将复苏的足细胞放入 33°C,5%CO2 孵箱中进行传代培养，培养液成分为 RPMI1640,10% 胎牛血清，以及补充剂（胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠,ITS）。当细胞生长至 70%-80%融合 时，转至 37°C,5%CO2 孵箱中使用相同的培养液继续培养 10-14 天，至细胞分化完全，选择60第 5-15 代分化完全的足细胞用于实验研究。实验分组：正常糖组( NG 5. 6mmol/L 葡萄糖)， 高糖组(HG 30 mmol /L 葡萄糖)，以及甘露醇组(M 5.6 mmol /L 葡萄糖 + 24. 4 mmol /L 甘露 醇)，根据实验要求培养不同时间后进行后续实验。1.2.2Real-time PCR 检测根据经典的操作规程，提取足细胞总 mRNA，用分光光度计测定样本中 RNA 的纯度和65含量，使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒加入 0.5mg 样本配制成 10ul 混合物，放置于逆转录 系统中进行 cDNA 合成，然后将 cDNA 样本在 ABIPRISM 7500 系统中进行 Real-timePCR 实 时定量分析。TRPC6 引物序列上游引物：5-GCCAATGAGCATCTGGAAAT-3；下游引物：5-TGGAGTCACATCATGGGAGA-3。在 ABIPRISM 基因分析仪上读取 Real-timePCR 数据 结果。701.2.3Western Blot 检测提取不同组细胞的总蛋白，低温离心后取上清，用 BCA 法测定蛋白浓度，每个样本取100ug 蛋白进行样品处理后用 10%SDS-PAGE 胶进行电泳，转膜封闭，4°C 孵育 TRPC6 抗 体及内参 -actin 抗体过夜，洗膜，室温孵育羊抗兔及羊抗鼠二抗 1h，用红外荧光扫描系统 进行检测，用 odyssey infrared 成像系统进行光密度积分值分析。751.2.4细胞内钙检测足细胞培养于多聚赖氨酸涂层的盖玻片上，70-80%融合后用标准细胞外液冲洗细胞 3次，加入用含 Fluo3-AM(3uM),0.03% F-127 的标准细胞外液 1ml 配置的染料 37°C 避光孵育45 分钟。染色后细胞使用共聚焦显微镜观察细胞内钙变化，与 Ca2+结合的 Fluo3 可以被 488nm处激光激发，可在 525nm 处探测到荧光发射。激光扫描共聚焦显微镜监测胞内游离钙浓度80依赖荧光强度变化，依次加入 1uMTG，1.8mMCa2+以及 100uM TRPC6 激动剂 OAG。胞内 钙离子浓度(Ca2+i)以相对荧光强度表达。1.2.5F-actin 染色足细胞培养于多聚赖氨酸涂层的盖玻片上，用 PBS 清洗后用 4%的多聚甲醛室温固定15 分钟，再用 TritonX-100 进行穿透，PBS 清洗后用 5ug/ml FITC-phalloidin 室温避光染色851h,PBS 清洗后，封片，于激光共聚焦显微镜下观察，拍片。1.2.6统计分析统计分析采用 SPSS16.0 分析软件进行数据处理，所有数据以 x±s 表示，双侧检验以P<0.05 判定差别有统计学意义，组间比较采用配对 t 检验。2实验结果90951002.1 高糖作用下足细胞 TRPC6mRNA 表达升高实时定量 PCR 显示高糖组与正常糖组相比，在 24h 时间点 TRPC6mRNA 表达高于正常 糖组（P<0.05),随着时间延长 TRPC6mRNA 表达逐渐升高，在 48h 升高更加明显（P<0.01）。 正常糖组与甘露醇组相比差异无统计学意义(P>0.05),（图 1）。图 1 高糖对足细胞 TRPC6mRNA 表达的影响，与正常糖组相比*P<0.05，*P<0.01。Fig1 The effect of high glucose on TRPC6mRNA in podocyte, *P<0.05, *P<0.01 versus NG.2.2 高糖作用下足细胞 TRPC6 蛋白表达水平升高Western-blot 结果显示，与正常糖组相比，在 24h 时间点高糖组 TRPC6 蛋白表达明显增 高（P<0.05）,随高糖作用时间延长，TRPC6 蛋白表达逐渐升高，至 48h 升高明显（P<0.01）， 结果与 Real-time PCR 检测结果一致。甘露醇组蛋白表达与正常糖组相比无统计学意义（P>0.05）,（图 2）。105110115120125图 2 高糖对足细胞 TRPC6 蛋白表达的影响。上图为 TRPC6 蛋白表达，下图为相应统计数据。数据用均值±标准误表示，n=3。*，与正常糖组相比 P<0.05，*，与正常糖组相比 P<0.01。Fig2 The effect of high glucose on TRPC6 protein in podocyte. TRPC6 protein level (above),Corresponding statistical data (below). Data are expressed as mean ± SEM n=3.*P<0.05, *P<0.01 versus NG.2.3 高糖作用下足细胞钙内流增加在静止的细胞内，Ca2+主要通过两种机制进入细胞内，一种是钙池调控钙离子内流（store-operated calcium entry,SOCE）,另一种是受体介导的钙离子内流（receptor- operated calcium entry,ROCE）.TG 可抑制内质网钙泵引起钙池被动性排空，从而激活 SOCE，研究证 实 TRPC6 可以被 DAG 所激活，使 Ca2+通过 ROCE 进入细胞内。我们用 DAG 类似物 OAG 检测高糖对足细胞内钙内流的影响。实验结果表明高糖增加 OAG 诱导的 ROCE(P<0.01),而 TG 诱导的 SOCE 没有变化(P>0.05),（图 3）。图 3 高糖对 TG 诱导的 SOCE 和 OAG 诱导的 ROCE 的影响.A 为单个细胞在实验过程中代表曲线。B,C 为 多次实验统计结果，实验结果表明高糖增加 OAG 诱导的 ROCE(*P<0.01, vs 正常糖组,n=5)而 TG 诱导的 SOCE 没有变化(P>0.05,vs 正常糖组，n=5)。Fig3 The effects of high glucose on TG-induced SOCE and OAG-induced ROCE.Representative traces (A)and summary data (B,C) showing that high glucose enhance OAG-induced ROCE(*P<0.01 versus NG,n=5),rather than TG-induced SOCE(P>0.05 versus NG,n=5).2.4 TRPC6 参与高糖作用下 F-actin 的重排正常条件培养足细胞，F-actin 经 FITC-phalloidan 染色后，显示 F-actin 被染成黄绿色的 长条细丝状贯穿于细胞全长。经过高糖作用后，细胞形态变圆，细胞内 F-actin 出现断裂重 排，应用 TRPC6 非选择性抑制剂 2APB 后，高糖所致的 F-actin 重排有所恢复，（图 4）。130135图4 TRPC6 在高糖诱导足细胞 F-catin 重组中的作用(×400).在 NG 和 M 组，F-actin 染色显示细胞内肌动蛋白呈明显规律的肌纤维样排列。HG 作用后肌动蛋白明显重排，预孵育 100M 2-APB 改变了这一高糖导致 的形态学变化。Fig4 The role of TRPC6 in high glucose-induced F-actin reorganization(×400).In NG and M groups ,a striking organization of stress fibers were showed.HG lead to reorganization,pretreatment of 100M 2-APB attenuated the morphological changes.1401451501553讨论糖尿病肾病中足细胞出现损伤，表现为足细胞密度数量的减少，足细胞肥大变性及足突 融合消失，足细胞骨架损伤在 DN 疾病发生发展过程中起到重要作用，但是关于足细胞骨架 损伤的机制并不明确。TRPC6 是 TRP 超家族中的一员，是一种非选择性阳离子通道，Winn 等利用免疫荧光首次发现 TRPC6 在正常人肾小球和肾小管表达。Reiser 等5通过激光共聚 焦进一步证实，TRPC6 在肾小球主要表达在足细胞。Moller 等6发现在人类非选择性蛋白尿 性疾病如 FSGS、微小病变性肾病和膜性肾病患者中，TRPC6 表达显著增加,他们还发现 TRPC6 表达增加可致足细胞肌动蛋白骨架分子重排和钙离子重新分布。然而，目前关于 TRPC6 在糖尿病肾病足细胞骨架损伤中的作用研究较少。足细胞是一种高度特异性，终末分化细胞，呈线状分布于肾小球基底膜的外部，构成阻 止蛋白漏出的最终屏障，在其分化的成熟阶段，足突与足突相接形成裂孔隔膜7。足细胞功 能的正常维持有赖于足突间的裂孔隔膜蛋白 Nephrin、podocin 和 CD2AP 等的正常定位和相 互作用，TRPC6 表达于足细胞的细胞体并且与 Nephrin、podocin CD2AP 等其它裂隙隔膜蛋 白共同表达于相邻两个足细胞膜结合区域5,8，而且有研究也表明在 Nephrin 基因缺失的小鼠 中足细胞裂孔隔膜断裂，TRPC6 过表达并且其分布也出现变化，这就表明 TRPC6 是位于足 细胞裂孔隔膜上的信号转导复合体的一个组成部分，而这个信号转导复合体对于维持足细胞 正常功能起重要作用。Donblier 等研究显示，DN 早期存在 nephrin 表达异常和重新分布9。 新近研究表明在糖尿病肾病活检的患者足细胞中 TRPC6 表达升高10。细胞骨架是维持足细胞结构和功能的核心因素，对于足细胞细胞骨架的持续性调节是维 持肾小球滤过屏障的至关重要的因素11。足细胞骨架主要由微丝蛋白，中间丝蛋白，微管 蛋白三种不同的超微结构组成。研究足细胞骨架改变往往以沿足突连续性表达的微丝蛋白 F-actin 作为代表。正常细胞中球状肌动蛋白（G-actin）与 F-actin 不断转换，达到平衡，并且只有聚合态的肌动蛋白才具有生物学作用。Siu 等研究发现高糖和糖基化终末产物可导致DN 肾小球足细胞骨架破坏12GraceM.Mitu 发现高糖作用足细胞后足细胞形态变圆，细胞间160165170175180185190195200205联系减少，F-actin 出现重排13。最近研究发现 TRPC6 与足细胞骨架之间也存在联系，体外 培养的足细胞 TRPC6 高表达则可以引起 F-actin 解聚和重新分布5。研究表明 TRPC6 激活 后可导致钙离子内流增多，进而激活钙离子依赖的磷酸化并且分解裂孔隔膜，改变了足细胞 足突的收缩结构，从而造成滤过系数的变化，最终会导致蛋白尿。本实验使用高糖作用于人肾小球足细胞,应用 Real-time PCR 和 Western-Blot 检测技术表 明，与正常糖组相比高糖组 TRPC6mRNA,蛋白表达明显增高，细胞内钙离子内流增加。高糖作用后足细胞 F-actin 出现重排，使用 TRPC6 抑制剂后 F-actin 改变有所恢复，表明 TRPC6参与了高糖诱导的足细胞 F-actin 损伤。高糖导致足细胞 TRPC6 表达升高的机制目前还不明确，许多研究表明氧化应激在高糖 引起 DN 的信号通路中起到重要作用14-16，在未来的实验中，我们会探讨氧化应激与 TRPC6 通道蛋白的关系。综上所述，高糖能导致体外培养的人肾小球足细胞 F-actin 改变，TRPC6 可能在其损伤过程中起到一定作用，具体机制有待进一步研究。参考文献 (References)1 Mclennan SV,FisherE,Martell SY,et al.Effect of glucose on matrix metalloproteinase and plasmin activite in mesangial cells;possible role in diabetic nephropathyJ.Kidney Int suppl,2000,77(58);81-872 Shankland SJ.The podocyte's response to injury :role in proteinuria and glomerulosclerosis J.KidneyInt,2006,69(12):2131-21473 Wolf G,Chen S,Ziyadeh FN.From yhe periphery of the glomerular capillary wall toward the center of disease :podocyte injury comes of age in diabetic nephropathyJ.Diabetes,2005,54(6):1626-16344 Resier J,poluR,Moller CC,et al.TRPC6 is a glomerular Slit diaphragm associated channel required for normal renal functionJ.Nat Genet,2005,37(7);739-7445 Winn MP,Conlon PJ,Lynn KL,et al.A mutation in the trpc6 cation channel causes familial focal segmental glomerulosclerosis J.Science,2005,308(5729);1801-18046 Moller CC,Weic,Altintas MM,et al.Induction of TRPC6 channel in aquired forms of proteinuric Kidney diseaseJ.AM.Soc Nephrol,2007,18(1);29-36.7 Saleem MA,O'Hare MJ,Reiser J et al.A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression J.Curropin Nephro hypertens,2006,15(1);1-7.8 MukerjiN,Damodaran TV,Winn MP.TRPC6 and FSGS;the latest TRP channel nelopathyJ.Biochim BIOphysActa,2007,1722(8);859-868.9 Doublier S,Salvidio G,Lupia E,etal.Nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy:evidence fora distinct role for glycated albumin and angiotensin IIJ.Diabetes ,2003,52(4);1023-1030.10 Florin Thilo,Ying Liu, Christoph Loddenkemper et al.VEGE regulates TRPC6 channels in podocyteJ.Nephrol Dial Transplant,2012,27(3);921-929.11 Faul C,Asamuma K,Yanagida-Asanuma E,et al.Actin up;regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeletonJ.Trends Cell Biol,2007,17:428-437.12 Siu B,Saha J,Smoyer WE,et al.Reduction in podocyte density as apathologic feature in early diabetic nephropathy in rodents;prevention by lipoic acid treatmentJ.BMC Nephrol,2006,7；6.13 Grace M.Mitu,Shinong Wang,Raimund Hischberg BMP7 is a podocyte survival factor and rescues podocytes from diabetic injuryJ.Physiol Renal physiol,2007,293(5);1641-1648.14 Gorin Y，Block K,Hermandez J,et al.Nox4 NAD(P)H oxidase mediates hypertrophy and fibronectinexperssion in the diabetic kidneyJ.Bio Chem,2005,280(47);39616-39626.15 Shah SV, Baliga R,Rajapurkar M,et al.Oxidants in chronic kidney diseaseJ.AM SocNephrol,2007,18(1);16-28.16 Schanackenbeg CG.Oxygen radicals in cardiovascular -renal diseaseJ.Curr OpinPharmacol,2002,(2)2;121-125.