人工染色体载体.ppt

第四章人工染色体载体,利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体。,人工染色体载体:,模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片段的DNA片段。,目前常用的人造染色体载体包括：,1978年J.Collins和B.Hohn等人发明构建1.8 kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45 kb。,第一节 黏粒（cosmid）载体,第一节 黏粒（cosmid）载体,黏粒克隆载体（柯斯质粒载体）实际上是质粒的衍生物，是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而成的，其原意是指带cos位点的质粒。,考斯质粒（cosmid）=质粒+cos序列。,它是用正常的质粒同噬菌体的cos位点构成。cos序列是l噬菌体DNA 中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。,黏粒它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA。克隆的最大 DNA 片段可达45kb。质粒复制起点（colE1）象质粒一样转化和增殖。抗性标记Ampr。cos位点。有的粘粒载体含有2个cos位点。,一、黏粒的结构特征和用途,一、黏粒的结构特征和用途,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；重组操作简便，筛选容易；装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围；不能体内包装，不裂解受体细胞。,二、构建cosmid克隆载体的策略,根据噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的这些性质，取长去短，设计由质粒和含有cos位点的这种DNA片段组装成一类新的克隆载体，即cosmid克隆载体。,由DNA片段和pBR322质粒DNA联合组成的。,cosmid载体-pHC79,pBR322质粒(p43),用噬菌体基因组的cror的Bgl限制片段，取代pBR322质粒DNA的位于1 4591 666bp之间的Sau3A片段，产生出具有Bgl单切割位点的重组体分子。,然后通过这个位点，将带有cos序列、长度为1.78kb的DNA之Bgl片段插入进去，于是得到了pHC79柯斯质粒.,DNA片段除了cos位点之外，在其两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA短序列；,质粒DNA部分则是一个完整的复制子。,克隆能力为3145kb，而且能够被包装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。,三、cosmid克隆载体的特征,构建的cosmid克隆载体是一种环形双链DNA分子，般在5-7kb。,cosmid克隆载体具有质粒的性质。,包括以下4个方面,cosmid克隆载体具有质粒的复制子，在大肠杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，同样也会获得扩增。,cosmid克隆载体通常也具抗菌素抗性基因，作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。,具有噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一个cos位点。,cosmid克隆载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。,进入寄主细胞之后的cosmid克隆载体DNA分子，便按照噬菌体DNA同样的方式环化起来。,但由于cosmid克隆载体并不含有噬菌体的全部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。,外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。,构建的cosmid克隆载体较小，因此能承载比较大的外源DNA片段。,如果cosmid克隆载体的大小为6.5 kb，按入噬菌体容许包装的量计算，能承载的外源DNA片段最大可达44.5 kb(即51 kb6.5 kb)，最小的也有29.9kb(即36.4kb6.5kb)，所以用这样的cosmid克隆载体能克隆40kb左右的外源DNA片段。,四、cosmid克隆载体的工作原理,cosmid克隆载体具有质粒克隆载体的性质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。,实际上，使用cosmid克隆载体主要利用它的噬菌体克隆载体性质。,因为cosmid克隆载体含有cos位点，可承载大的DNA片段，进行体外包装后能高效率转导受体细胞。,使用cosmid克隆载体的程序与使用噬菌体克隆载体的程序有所不同。,作为噬菌体克隆载体，线形重组DNA分子两端必须各有一个cos末端。而cosmid克隆载体只有一个cos位点，因此必须先对cosmid克隆载体进行适当处理，构成具有两个cos位点的二联体线形DNA分子。,当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子，并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具有两个cos末端的重组DNA分子，就能进行有效的体外包装。,使用cosmid克隆载体的基本程序是：,先用一种限制性核酸内切酶切割cosmid克隆载体,具有两个cos位点的二联体线形DNA分子,DNA连接酶,切割二联体线形DNA分子和部分切割待克隆的外源DNA片段,成为可用于体外包装的样品,DNA连接酶,限制性核酸内切酶,不管是(a)程序还是(b)程序，最后获得的重组线形DNA分子必须保留质粒的复制起始位点(ori)和选择标记基因，保证重组的线形DNA分子导入受体细胞后，cos末端自行连接环化，按质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达选择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。,五、cosmid克隆载体（自学P72）,常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组DNA文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适合高等真核基因的克隆工作。,六、构建cosmid文库应注意哪些问题,载体分子的自身连接，从而导致效率降低或者失败。载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；,大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子。结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出3045kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；,细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。YAC具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受100-1000kb的外源DNA片段。,第二节 酵母人工染色体载体,这种人工染色体克隆载体实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。,第二节 酵母人工染色体载体,ARS1,一、YAC载体的复制元件和标志基因,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子酵母染色体的着丝粒序列 酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子标记YAC载体的装载量为250-400 kb,这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制。这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。,筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型。,人工染色体克隆载体的特点：能容纳长达1000 kb甚至3000 kb的外源DNA片段。,人工酵母染色体克隆载体的构建,YAC(酵母人工染色体)克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体。,将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA复制起点(ARS)和着丝粒(CEN)以及必要的选择标记(HISA4和TRPl)基因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，构建成YCA克隆载体。,ARS1,二、YAC载体的工作原理,此克隆载体的sup4(抑制基因：抑制赭色表型)基因上，组装了供插入外源DNA片段的克隆位。,常用的YAC克隆载体有3种：,pYAC3、pYAC4和pYAC5。,差别：在sup4基因上的克隆位点不同，分别是SnaBI、EcoRI和NotI。,（红色，赤红色）,主要结构：两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；酵母菌着丝粒序列(centromere4,CEN4)；一个自主复制序列(ARS1)；两个来自嗜热四膜虫(Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构；,YAC载体-pYAC4,在两个末端序列中间，有一段填充序列(HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增；Amp抗性及细菌质粒复制原点；一个EcoR克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。,克隆载体pYAC4,首先用EcoRI和BamHI双酶切割，获得均具BamHI和EcoRI切割末端的两个DNA片段(双臂)，随后把两端具EcoRI切割末端的外源DNA与此双臂连接，构成酵母人工染色体。用电激仪把此人工染色体转化酵母受体细胞。,在成功构建pYAC4克隆载体的基础上，进一步构建了人类人工染色体(HAC)克隆载体和哺乳动物人工染色体(MAC)克隆载体。,pYAC4使用程序：,Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色表型(成为白色)。不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。,选择标记-Sup4,一般酵母表达载体都以大肠杆菌质粒为基本骨架再加上酵母的自主复制序列，选择标记，外源基因插入位点，启动子和终止子。既能在酵母菌中复制也能在大肠杆菌中复制，所谓酵母菌大肠杆菌穿梭载体。,正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel)*酵母自主复制序列（ARS)*酵母着丝点(CEN)*酵母的选择标记(TRP1、URA1),YAC载体,启动子和终止子的选择；表达盒的稳定性；外源蛋白的累积部位；产量的提高。,理想的酵母表达系统要考虑,酿酒酵母作表达系统的缺点,在YAC载体中的插入片段会出现缺失和重排的现象。容易形成嵌合体。即在单个YAC中的插入片段由2个或多个独立的基因片段连接组成的现象。YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，YAC染色体转入酵母细胞后很难从中分离出来。,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300 kb之间。,第三节 细菌人工染色体载体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,一、BAC载体及其结构,BAC 载体的大小约7.5 kb，其本质实际上是一个质粒克隆载体。与常规克隆载体的核心区别在于其复制单元的特殊性。BAC复制单元来自F质粒。,一、BAC载体及其结构,正常细菌人工染色体含有：严谨型控制的复制区（oriS)启动DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（RepE)确保3个低拷贝并使质粒精确分配到子代细胞的基因座。（parA、parB、parC),一、BAC载体及其结构,标记基因是氯霉素抗性基因（Cmr)可以通过-互补原理筛选重组子设计了用于回收克隆DNA的NotI酶切位点。用于克隆DNA片段体外转录的SP6和T7启动子。,Structure of a bacterial artificial chromosome(BAC),used for cloning large fragments of donor DNA.CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance.oriS,repE,parA,and parB are F genes for replication and regulation of copy number.cosN is the cos site from l phage.HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted.The two promoters are for transcribing the inserted fragment.The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.,二、BAC载体工作原理,BAC载体的工作原理与常规的质粒克载体相似。不同的是：BAC载体装载的是大片段DNA，一般在100Kb300Kb。对如此大的DNA片段一般要通过脉冲凝胶电泳分离。BAC载体的拷贝数小，制备难度大。,二、BAC载体工作原理,解决方法：将 BAC载体装载作为外源片段克隆到常规高拷贝质粒克载体上，如（pGEM-4Z），从大肠杆菌中以多拷贝的形式复制，便于载体的制备，使用时将高拷贝质粒去掉。,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝pBACs主要适用于：,二、BAC载体工作原理,BAC载体,噬菌体P1基本特征：不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。,第四节 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体（略）,PAC载体,人工染色体克隆载体的应用,1、构建基因组文库2、基因治疗3、基因功能鉴定,载体的种类和特征,