壳多糖组织工程支架材料的制备及其应用1.doc

精品论文大全壳多糖组织工程支架材料的制备及其应用1陈彦彦 1，陈昕 2，王宗良 1，赵雷 2，石毅 1，周余来 1，颜炜群 11 吉林大学药学院，吉林长春（130021）2 深圳市人民医院，广东深圳（518020）E-mail：zhouyl摘要：本文探索一种简单的制备壳多糖细胞外基质网架的方法，考察将其作为组织工程支 架材料应用的可行性。将壳多糖经乙酸溶解后，搅拌成均匀泡沫状，冷冻铸型制成海绵状多孔基质网架。应用该网架构建组织工程软骨和复层组织工程皮肤。所制备的网架外观呈多孔海绵状，利用光镜、电镜技术测定孔径在 83136µm 之间，平均孔径为 110µm，平均三维 空孔率为 78%。应用该网架构建组织工程软骨，软骨细胞在网架上黏附、增殖良好并分泌 细胞外基质，有新生软骨组织形成。所构建复层组织工程皮肤具有与天然皮肤极为相似的表 皮和真皮双层结构。提示所制备网架适于细胞黏附生长和增殖，将其作为组织工程支架材料 具有较好的应用前景。关键词：组织工程；壳多糖；支架；软骨；皮肤1. 引言壳多糖是从虾、蟹等海洋生物中提取的几丁质经脱乙酰化后得到的一种天然多糖。壳多 糖的结构及某些性质与细胞外基质中的主要成分氨基多糖极为相似。壳多糖具有无毒、无刺 激性、生物相容性良好、可生物降解等诸多优良性质，被广泛应用于食品卫生、工业废水处 理、医药制剂、畜牧业生产及造纸等领域1。近年来，壳多糖材料在组织工程领域也有了一 定应用。本研究探索一种简单的壳多糖基质网架制备方法，并考察所制备壳多糖基质网架作 为组织工程支架材料应用的可行性。2. 材料和方法2.1 主要试剂壳多糖（吉林德众生物技术开发有限公司，脱乙酰度 95%）,乙酸（AR,北 京化工厂）,NaOH(AR,北京化工厂)，DMEM 培养基(GIBCO),HamF12 培养基(GIBCO),新生 小牛血清（GIBCO）,中性蛋白酶(Dispase)(GIBCO),胰蛋白酶(GIBCO),I 型胶原酶（GIBCO）, II 型胶原酶（GIBCO）,胰岛素(GIBCO)，两性霉素 B(GIBCO),转铁蛋白(GIBCO),表皮细胞生 长因子（EGF）(PEPROTECH),腺苷酸（GIBCO）。2.2 培养基 基础培养基：DMEM 培养基，含青霉素 1.0×105U/L，链霉素 100mg/L。常规 培养基：基础培养基+15%新生小牛血清。生长培养基：DMEM:F12=3:1，含 15%新生小牛血清，胰岛素 6mg/L，青霉素 1.0×105U/L，链霉素 100mg/L，转铁蛋白 5mg/L，两性霉素 B250µg/L，EGF 20µg/L。D-Hanks 缓冲液按文献方法配制2。2.3 实验动物：清洁级新西兰白兔和 Wistar 新生大鼠由吉林大学基础医学院实验动物中心 提供。（动物饲养合格证号：NO.0006007）2.4 壳多糖基质网架的制备、结构测定及使用前预处理2.4.1 网架的制备将壳多糖溶于 1.5%的乙酸中，配成浓度为 2%的壳多糖/乙酸溶液。以 2000r/min 的速度1本课题得到教育部高校博士学科点基金项目（20030183059）和吉林省科技厅重点项目资助课题（20050401-2）的资助。-7-搅拌 30min 至均匀泡沫状，迅速移至平皿中，液氮速冻，铸型后冷冻干燥，形成海绵状多孔网架。在 10%的 NaOH 溶液中浸泡 3 h，取出后以双蒸水洗至中性。37烘干，备用。2.4.2 网架形态结构的测定 一般形态结构：网架10%甲醛固定梯度乙醇脱水透明浸腊包埋切片（厚度为 5µm）脱腊HE 染色树脂封片。光镜下观察其结构，摄片。采用 CIAS-400 真彩色医学图像分析仪，测定其孔径大小及空孔率。 超微结构：网架清洗4%戊二醛固定1%锇酸固定梯度乙醇脱水醋酸异戊酯置换CO2 临界点干燥（31.4，78 大气压）喷镀金膜扫描电镜观察，摄片。测定其孔径 大小及空孔率。2.4.3 网架使用前的预处理使用前，将网架按以下步骤处理：D-Hanks 液浸泡 24 h75%酒精浸泡 30min两面分 别在紫外灯下照射 60min常规培养基浸泡 24 h 以上植入细胞培养。2.5 壳多糖基质网架的应用2.5.1 构建组织工程软骨软骨细胞的分离培养参照本实验室方法3进行。向壳多糖细胞外 基质网架接种传代的软骨细胞（1.0×106cell/ml），培养。组织工程软骨的超微结构测定：取不同培养时间的组织工程软骨，经 4%戊二醛前固定1%锇酸后固定乙醇梯度脱水氧化丙烯置换Epon812 包埋超薄切片醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色透射电镜观察，摄片。2.5.2 构建复层组织工程皮肤皮肤细胞的分离培养参照本实验室的方法4、5进行。向壳多糖 基质 网架两面分别 接种传 代的成纤维细 胞（ 3.0×105cell/ml ） 和 传代的 角朊细胞 （5.0×105cell/ml），培养。 复层组织工程皮肤一般形态结构测定：分别取不同培养时间的组织工程皮肤，经 10%甲醛固定梯度乙醇脱水透明浸腊包埋切片（厚度为 5µm）脱腊HE 染色树 脂封片。光镜下观察其结构，摄片。3. 结果3.1 壳多糖基质网架的形态学测量结果本研究制备的壳多糖基质网架的一般结构和超微结构如图 1-5 所示。采用医学图像分析 仪测量结果显示，所构建网架的孔径在 83136µm 之间，平均孔径为 110µm。平均三维空 孔率为 78%。与文献报道的以其它材料制备的基质网架的孔径与空孔率大小比较如表 1 所 示。表 1 几种基质网架孔径和空孔率的比较网架来源孔径（µm）空孔率（%）Boyce650150Yannas7 7090 96 程友81003008286 申雄军910040094.8 赵东锷10179朱爱萍111203.2 培养的复层组织工程皮肤和组织工程软骨的形态结构经形态学检测，结果表明本研究所构建的组织工程软骨中软骨细胞在网架上黏附、增殖 良好并能分泌细胞外基质；组织学观察显示有新生软骨组织形成。参见图 6-7。所构建的复层组织工程皮肤具有与天然皮肤极为相似的表皮和真皮双层结构，角朊细胞和成纤维细胞贴附于网架上生长、增殖，形成连续的细胞层，细胞层数增多明显，并分泌角 质样物质和基质样物质，网架逐渐降解。参见图 8-9。4. 讨论可用于构建组织工程构件的基质网架材料有许多种，如胶原、壳多糖、聚乳酸、聚亚胺 脂、羟基磷灰石等。不论应用何种原料，都要满足如下最基本的要求：无毒性、无热源性、 无免疫原性、无致敏性等，还应具有生物相容性、生物可降解性和一定的生物力学强度等。壳多糖是几丁质的脱乙酰化合物，无毒、无味，是一种新型的天然医用生物材料。以壳 多糖构建的基质网架，具有良好的生物力学性能、组织相容性、生物可降解性，可抑菌、消 炎、促进伤口愈合，无毒性，无排斥性，无热源性，无刺激性，无致突变性，无溶血性等12。 另一方面，壳多糖来源广泛，价格低廉，性质稳定，制备过程简便，重复性好。多糖材料是软骨细胞的良好载体，它能够参与细胞信使传递和免疫反应，因此广泛地应 用于生物材料领域。许多学者研究了壳多糖复合材料植人体内后的机体反应，壳多糖支架植 入缺损，一般只会导致很小的异物排斥反应。移植物周围有较多中性粒细胞聚集，但它们会 很快消散，不引起慢性炎症，没有大量纤维组织增生。同时，壳多糖刺激免疫细胞分泌生长 因子、细胞因子，它们可作用于缺损周围细胞使之加快增殖，从而加速移植物与正常软骨组 织的融合。壳多糖还能与体内阴离子多聚体肝素形成电解质复合物，促进细胞有丝分裂，诱 导合成生长因子如 bFGF 并延长其半衰期。研究表明，壳多糖载体一方面作为支架，提供软 骨细胞三维生长的环境，另一方面还通过多种途径刺激细胞增生，维持功能表达，促进软骨 组织重建。本研究应用所制备的壳多糖细胞外基质网架构建的组织工程软骨经检测软骨细胞 在网架上黏附、增殖良好并能分泌细胞外基质；组织学观察显示有新生软骨组织形成。壳多糖本身是构成细胞外壁的主要多糖类物质，可被溶菌酶分解而降解吸收。因此，应 用壳多糖作为组织工程皮肤和软骨的基质网架材料，在材料的铸型、培养细胞的占位和材料 自身降解直至被吸收等方面，有更为优越之处。以此基质网架构建的组织工程软骨有新生软 骨组织形成，构建的复层组织工程皮肤，在较短时间内就能够再现出与天然皮肤相似的组织 结构。这些优良的性质是胶原和聚乳酸等其它基质网架材料无法比拟的。因此，近年来人们 对壳多糖在医用辅料、创面修复、人造皮肤、人造眼泪、骨内固定材料及中药制剂等医药领域的应用进行了广泛的研究13。 在复合组织工程皮肤的研制中，选择一种合适的支架材料，是其中的重要环节。本研究制备了具有一定孔径和空孔率的壳多糖网架，并应用该网架在体外构建复层组织工程皮肤。 结果表明，所制备的组织工程皮肤具有与天然皮肤极为相似的表皮和真皮双层结构，角朊细胞和成纤维细胞贴附于网架上生长、增殖，形成连续的细胞层，细胞层数增多明显，并分泌角质样物质和基质样物质，网架逐渐降解。壳多糖较难溶于水，在酸性条件下易溶解。用 1.5%的乙酸溶解，经高速搅拌后，呈丰 富的泡沫。再经速冻、冷冻干燥后，形成海绵状多孔网架。在扫描电镜下观察，网架错综相 连成许多网孔。多孔结构可以通过在适宜的模具中冷冻和冷冻干燥壳多糖的乙酸溶液获得， 壳多糖支架的机械性能主要依赖于孔径和孔的取向。网架孔径均匀度及大小主要受以下因素 的影响：搅拌速度、搅拌时间和冷冻速率。一般地讲，搅拌的时间越长、速度越高，则泡沫 越均匀，所得网架的孔径和孔隙也就越均匀。实验发现，冷冻速率对网架孔隙的影响也不容 忽视。冷冻速率过大和过小，形成的网孔都不均匀。实验确定一个合适的搅拌速度和冷冻速 率，是成功制备网架的关键。本研究介绍的方法是目前壳多糖基质网架诸多制备方法中最主要的一种，该方法具有操 作简便，制备条件可根据实际需要灵活掌握的优点。在实际应用中，也可以根据不同实验的 具体要求，采用壳多糖与明胶的混合物，或者是壳多糖的衍生物来制备具有不同性质和用途 的基质网架14。5. 结论综上所述，本研究以壳多糖为基本材料，制备了多孔海绵状三维细胞外基质网架，并进 一步应用该网架构建了复层组织工程皮肤和组织工程软骨。该复层组织工程皮肤在组织结构 上再现了天然皮肤的表皮与真皮层次，组织工程软骨由新生软骨组织出现。皮肤细胞和软骨 细胞贴附于网架，生长增殖状况良好，并分泌细胞外基质。为将壳多糖作为基质网架材料应 用于组织工程领域提供了参考数据，为最终将组织工程皮肤和组织工程软骨应用于临床奠定了重要的基础，也为将来壳多糖作为基质网架构建其它人工组织器官提供了可能。图 1 壳多糖网架大体观察图 2 壳多糖网架光镜下观察（HE×100）图 3 壳多糖网架扫描电镜下观察（×120）图 4 壳多糖网架扫描电镜下观察（×300）图 5 壳多糖网架扫描电镜下观察（×1500）图 6 以壳多糖网架构建的组织工程软骨扫描电镜观察（×1000）图 7 以壳多糖网架构建的组织工程软骨透射电镜观察（×5000）图 8 以壳多糖网架构建的构建的复层组织工程皮肤（3W，HE×100）图 9 以壳多糖网架构建的构建的复层组织工程皮肤（4W，HE×100）参考文献1 Xue YM, Du YM, Huang RH, et al. Preparation and modification of N-(2-hydroxyl) propyl-3-trimethyl ammonium chitosan chloride nanoparticle as a protein carrier. Biomaterials, 2003, 24, 5015-5022.2 鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术M. 北京出版社, 1995, P85.3 池光范,侯宜,周余来,等.应用几丁质胶原网架构建组织工程软骨.吉林大学学报（医学版），2004, 30(5):697-699.4 Zhou yu lai, Ma Gang, Hou li zhong，et al. Animal grafting experiment of reconstructive tissue engineeredartificial skin made by chitoson as stromal scaffold Chinese Journal of Clinical Rehabilitation. 2005,9(2): 236-238. 5 马刚,石毅,周余来,等.复合培养人工皮肤的细胞生物学规律. 吉林大学学报（医学版）,2005, 31 (4):495-497.6. Boyce ST, Hansbrought JF. Biologic attachment, growth and differtiation of cultured human epidermal keratinocytes on a graftable collagen and chondroitin-6-sulfate substrate. Surg. 1988, 103(4): 421-4317 Yannas IV, Burke JF, Gordon PL, et al. Design of an artificial skin: II.Control of chemical composition. 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Solute chitosan into acetic acid, stir them to uniformity cystose , refrigerate and cast form into porosity sponginess wire frame. Reconstruct tissue engineering skin and cartilage with chitosan scaffold and skin cells and cartilage cells. Chitosanextracellular matrix wire frame looks porosity sponginess, determine its pore size of 83 136µm(average 97µm) and vacancy volume of 75% with the help of light microscope and electron microscope. Cartilage cells sticking on wire frame grow and proliferate well, they also secrete extracellular matrix. It manifest generation of new cartilage tissue. The Tissue Engineering Skin is very similar with natural skin and has bilayer structure. The chitosan extracellular matrix wire frame made in the research is fit for cells growth and proliferation. There will be brilliant application perspective as tissue engineering scaffold.keywords: Tissue Engineering; Chitosan; Scaffold; Cartilage; Skin.