肌联蛋白基因突变与中国人扩张型心肌病相关性研.doc

精品论文大集合肌联蛋白基因突变与中国人扩张型心肌病相关性研究1刘星 1，饶莉 1，周斌 2，张蓓蕾 2，王艳云 2，陈斌 1，吴洋 1，黄萍 11. 四川大学华西医院心内科，成都（610041）2. 四川大学华西基础医学与法医学院，成都（610041）E-mail: lrlz1989摘要：目的：2002 年日本报道了肌联蛋白基因（TTN）第 3、14、49 外显子的 4 个基因突变可能与扩张性心肌病（DCM）发病相关。本文试图探讨在中国人基因背景下可能存在 的 TTN 突变及其与我国 DCM 的关系。方法：采用聚合酶链反应- 单链构象多态性（PCR-SSCP）方法、聚丙烯酰胺凝胶电泳及 DNA 序列测定对 117 例 DCM 患者和 120 例健 康对照者 TTN 的第 3、14、49 外显子的多个位点进行检测、分析。结果：我国 DCM 患者 和健康对照者中未发现与日本 DCM 患者相同位点的基因突变。但在两名有明确 DCM 家族 史的儿童患者（1.7%）中发现了位于 TTN 第 49 外显子的 13053 位点基因突变：GA 突变（G13053A），导致第 4351 位点氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸（Gly4351Asp）。在健康对照 组中未发现此改变。结论：本研究首次在中国 DCM 患者中发现存在于 TTN 第 49 外显子的错义突变，该突变可能是 DCM 重要的病因学机制，尤其可能与早发 DCM 相关。关键词：扩张型心肌病；肌联蛋白；基因突变；PCR-SSCP；DNA 测序扩张性心肌病（dilated cardiomyopathy, DCM）是一类以一侧或两侧心室扩张、心肌收缩 功能受损为特征的原发性心肌疾病。其病理表现为心肌的纤维化和残余心肌肥厚，是临床上 引起心律失常、心衰和心脏性猝死主要原因之一，也是导致心脏移植的第二大原因1。尽管 DCM 病因不明，但近年来的研究报道2有 20-35%的患者存在明显的家族史，并伴随多种遗 传方式，其中包括常染色体显性遗传（最为常见）、常染色体隐性遗传、X-连锁遗传以及线 粒体方式的遗传，大量的研究也证实2有超过 17 个基因的突变可能与 DCM 发病有关。肌联蛋白（titin）是最重要的细胞骨架蛋白之一，普遍存在于心肌（占心肌蛋白的 10%） 和骨骼肌，被称为第三肌丝，具有复杂的结构以及多种多样的功能3。国内外大量的研究已 经发现重症肌无力、骨骼肌营养不良症等均与 titin 的功能改变密切相关4、5。2002 年国外学者先后发表了三篇重要报道6、7、8：肌联蛋白基因（TTN）突变可以导致 zebrafish 胚胎心脏的扩张性心肌病样心肌病变；不同位点的 TTN 突变均与 DCM 相关。其中最有影响的是日 本学者发现了8在 TTN 的 3 个外显子（3、14、49）中存在 4 个基因突变(在 titinZ 线区域的 Val54Met 和 Ala743Val，在心脏特异性 N2B 区域的 Gln4053ter 和 Ser4465Asp)，且这些突变 均与 DCM 发病密切相关。而后的一系列研究也发现9、10 TTN 突变导致的 titin 改变与 DCM、 肥厚型心肌病、心衰甚至法洛氏四联征的发生相关。然而，国内对 titin 与心肌疾病的相关 性研究却是一项空白。本研究旨在了解在中国人基因背景及环境因素下是否存在 TTN 第 3、14、49 外显子的突变，以及其与我国 DCM 发生是否相关，进而探讨 DCM 可能的发病机制， 为临床早期诊断和防治提供更积极和广阔的视野。1 对象和方法1.1 研究对象本研究选择 117 例汉族扩张性心肌病患者，男性 74 例，女性 43 例，其中家族性 3 例；1本课题得到教育部高等学校博士学科点专项基金（20070610144）的资助。- 6 -平均年龄（58±13）岁，全部符合 WHO1995 年制定的 DCM 诊断标准；排除有明确继发因素者：如病毒性心肌炎、缺血性心肌病、瓣膜性心脏病、高血压病、代谢性心肌病、结缔组 织病、神经肌肉病变等系统疾病等。对照组健康汉族人 120 例，男女各 60 人，平均年龄（54±11） 岁（患者和对照组的临床及超声心动图特点对比详见表 1）。所有受试者均授以知情同意书。1.2 实验方法采用 PCR-SSCP-DNA 测序方法进行研究。该技术模拟 DNA 的天然复制过程，并能敏 锐地将碱基发生改变时导致的 DNA 单链构象差异分离开来，最后通过 DNA 序列测定鉴别 突变 DNA。聚合酶链反应（ Polymerase chain reaction，PCR）：采集DCM患者及对照组个体外周静 脉全血约1ml，EDTA-Na2抗凝后用Chelex2100法提取DNA备用。分别设计3对引物：Pa1:5-TGGGACAGAGCAGAGGACTT-3 和Pa2:5-CTTTCCCAATTTGCTGGAGA-3;Pb1:5-CGTCGAGAAGTAACTGGCAAA-3 和Pb2:5-CCAGGTACCCTAAAGGCACA-3; Pc1:5-TGCCTGATAAGGAGGCATGT-3 和Pc2:5- TGTGCCAATGTATGGCATTT-3。它们引自 NCBI (TTN cDNA 序列, X90568)。扩 增产物分别为241bp、380bp、和346bp。PCR反应体系37.5µl，含基因组DNA2µl（2-10ng）， 引物1.5µl(10 Pmol/µl)，Taq DNA聚合酶1.5U，10×反应缓冲液3.75µl，1×dNTP6µl， MgCl22.25µl(25mmol/ml)，无菌去离子水21.7µl。PCR反应条件：采用PE-9600型DNA扩增仪，94预变性3min；循环36个周期（94变性35s；63-66退火45s；72延伸55s）；72末次延伸7min；-20保存。单链构象多态性（Single-strand conformation polymorphism , SSCP）分析：SSCP是敏感 性和特异性均高的检测方法，它可以快速而有效地检测400bp的短DNA序列。如前所述3 个PCR产物分别命名为LX-A(241bp), LX-B(380bp), LX-C(346bp)。各取PCR产物5µl，加入等 体积变性上样缓冲液(95甲酰氨，10 mmol EDTA,0.02%溴酚蓝)，稍离心后煮沸10min，取 出立即冰浴5min以上，然后上样于10非变性聚丙稀酰胺凝胶(含10甘油，交联度5%)，4 同步电泳。300v电泳10min，200v电泳20h。硝酸银染色，分析并保存结果。DNA序列测定：单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种空间构象主要是由其内部 碱基配对等分子内相互作用力来维持的。当有碱基发生改变时，会使其空间构象发生改变， 因而有基因突变的DNA片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳带迁移率与正常相比会有明显差异，如 出现额外区带或带的位置异常等。进而选择有可疑区带的PCR产物进行DNA测序，即可发现 突变的碱基。本研究采用3sPCR product purification nit V3.02对目的DNA片断进行纯化，样 本送上海申能博彩生物技术公司进行DNA 序列测定。全部测序结果经BLA ST 对比验证。2 结果2.1 心脏特异性 N2B 区域的检测结果分析在心肌细胞内，titin 具有最重要的心脏特异性 N2B 区域，它是 titin 弹性基本元件之一， 产生回复力和被动张力，参与构成分子弹簧；同时也是信号传递的热点区域。本研究通过分析代表编码心脏特异性 N2B 区域的 TTN 第 49 外显子的电泳图谱，与正 常对照组的电泳图谱相比较，发现在两名（1.7%）有明显 DCM 家族史的儿童患者（姐姐12 岁，弟弟 10 岁，排除骨骼肌疾病和其他疾病）中明显多出两条电泳条带，而其余 115 例 患者包括上述两名儿童患者的父亲（亦为 DCM 患者）均未发现相同的异常电泳图谱（图 1、2）。DNA 序列分析显示，该异常电泳条带系位于第 49 外显子的 13053 位点基因突变：GA突变，导致第 4351 位点氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸（Gly4351Asp），该突变为杂合状态（图 3）。由于出现了氨基酸性质的明显改变，因此该突变具有重要意义。2.2 titinZ-线区域的检测结果分析Titin 的 Z-线区域具有固定 titin 分子的重要作用，被称为应力感受器。在这个区域日 本研究人员曾发现了与 DCM 相关的两个突变 Val54Met 和 Ala743Val。本研究结果显示， DCM 患者的第 14 外显子与对照组相比较未发现异常（图 4、5），DNA 序列测定也未发现 与日本患者相同的或者新的基因突变（图 6）。此外本研究还检测了 TTN 的第 3 外显子，也未发现任何异常改变。3 讨论Titin 也称为肌联蛋白（connectin），是普遍存在于横纹肌的第三肌丝，是由单基因编码 的最大蛋白（分子量约 33.7Mda）。单个 titin 从 Z 线到 M 线横跨半条肌小节，形成它特有 的 Z-线、I-带、A-带区域，构成复杂的结构。它不仅具有显著的生物力学性质，产生回复力 和被动张力并调节主动张力；还参与多种离子、蛋白间的反应，具有信号传导、调控基因表 达等生物化学性质。一系列研究显示4、5、8、9、10titin 基因的改变与多种肌病的发病有关，如 骨骼肌营养不良症、扩张性心肌病、肥厚型心肌病等。尤其自 2002 年日本研究人员报道了 位于 TTN 第 3、14、49 外显子的 4 个基因突变与 DCM 的发病密切相关以来，相当长一段 时间内我国的相关研究仍是一项空白8。如前所述，titin 不仅具有复杂的生物力学特性，还具有显著的生物化学功能，其心脏 特异性 N2B 区域不仅参与形成分子弹簧，还能通过蛋白-蛋白、离子-蛋白等参与分子间的 信号传递3、11。在 N2B 区的远端有很强的 B-晶状体蛋白（B-crystallin）亲和力。B-crystallin 是一种低分子量的热休克蛋白，有报道12B-crystallin 的 Arg157His 突变可能通过损害 B-crystallin 与 N2B 区域的亲和力而导致 DCM 的发病。此外，N2B 区的远端还与 DRAL/FHL-2 紧密结合，一方面确保收缩时 ATP 的产生，另一方面 DRAL/FHL-2 还影响 I- 带其它代谢酶的功能活性13。此外 N2B 区还是由蛋白激酶 A 介导的磷酸化过程的靶目标， 磷酸化会破坏 titin 的自然结构14。N2B 区域的功能如此重要，所以我们设想该区域如果遭 受任何改变将会造成严重的机能障碍。事实上，日本研究人员报道的 Gln4053ter 和 Ser4465Asp 突变就位于该区域，而本研究所发现的基因突变 Gly4351Asp 也正是位于 N2B 区域的远端。由于本研究发现的杂合突变存在于两名有明显 DCM 家族史的儿童姐弟患者， 未在成年患者及健康人群中存在，因此我们推测 Gly4351Asp 杂合突变可能与早发 DCM 相 关。外显子 3、14 位于 titin 的 Z-线区域，该区域是 titin 重要的结构功能区，包括 Z1Z2、Z-r1-7（即七个串联的重复序列）和 Z3-9，它们没有伸展性，起固定 Z-线两侧 titin 的作用，并参 与“应力感受器”的功能活动，同时也是 titin 信号传递的热点区域3。其中“应力感受器”的典 型结构即为 titin/T-cap 复合物。T-cap 与 titin 的 Z1Z2 高度特异性结合，将 Z-线两侧的 titin 锚 定在 Z-线形成一个异源三聚体，具有很强的机械强度，以承受肌肉伸展时 titin 产生的较大 被动张力。研究显示15只有 T-cap 和 Z1Z2 结合，T-cap 才有稳定的构象，titin 的 N-端也才 是稳定的且具有抗机械应激的能力。日本研究人员8也证实位于编码 Z1Z2 的第 3 外显子 Val54Met 的突变确会导致 Z1Z2 与 T-cap 间亲和力的降低，与 DCM 相关。此外，Zr1-7 与肌动蛋白（actin）和 -辅肌动蛋白（-actinin）形成三元络合物，能抵抗收缩时的压缩力，维持 titin 的弹性区功能。日本 DCM 患者8中存在的 Ala743Val 突变即位于编码 Zr1-7 的第 14 外显子，也已证实该突变会降低 Zr1-7 与 -actinin 的亲和力并与 DCM 发病相关。本研究没 有发现与上述相同的改变，也未发现新的突变，说明在我国汉族 DCM 患者中可能并不存在 titin 第 3 和第 14 外显子的基因短序列改变。然而，titin 是目前发现的最大蛋白，它有 363 个外显子，本研究仅选择了其中三个作为 研究对象，更多更广泛的深入研究还需进行，以阐明 titin 与中国 DCM 的关系。参考文献1Maron BJ, Towbin JA, Thiene G, et al. Contemporary definitions and classification of the cardiomyopathies: an American Heart Association Scientific Statement from the Council on Clinical Cardiology, Heart Failure and Transplantation Committee; Quality of Care and Outcomes Research and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups; and Council on Epidemiology and Prevention. Circulation 2006; 113: 1807-1816. PMID: 165675652Taylor MRG, Carniel E, Mestroni L. Familial dilated cardiomyopathy. Orphanet Encyclopedia.2003;Jul:1-7.3Henk L. Granzier, Siegfried Labeit. The Giant protein titin: a major player in myocardial mechanics, signaling, and disease. Circulation Research. 2004; 94:284-295.4Udd B, Vihola A, Sarparanta J, et al. Titinopathies and extension of the M-line mutation phenotype beyond distal myopathy and LGMD2J. Neurology. 2005, 64:636642.5Hackman P, Vihola A, Haravuori H, et al. Tibial muscular dystrophy is a titinopathy caused by mutations in TTN, the gene encoding the giant skeletal-muscle protein titin. Am J Hum Genet. 2002;71:492500.66Xu X，Meiler SE, et al. Cardiomyopathy in zebrafish due to mutation in an alternatively spliced exonof titin. Nature Genetics. 2002, 30:205209.7Gerull B, Gramlich M, Atherton J, et al. Mutations of TTN, encoding the giant muscle filament titin, cause familial dilated cardiomyopathy. Nature Genetics. 2002, 30:2012048Itoh-Satoh M, Hayashi T, Nishi H, et al. Titin mutations as the molecular basis for dilated cardiomyopathy. Biochem Biophys Res Commun. 2002;291:385393.9Arnold M. Katz, Michael R. Zile. New molecular mechanism in diastolic heart failure. Circulation. 2006,113:1922192510Nann L, Pieroni M, Chimenti C, et al. Hypertrophic cardiomyopathy: two homozygous cases with “typical” hypertrophic cardiomyopathy and three new mutations in cases with progression to dilated cardiomyopathy. Biochemical and Biophysical Communications. 2003, 309:391398.11Pyle WG, Solaro RJ. At the crossroads of myocardial signaling: the role of Z-discs inintracellular signaling and cardiac function. Circ Res. 2004;94:296-305.12Inagaki N, Hayashi T, Arimura T, et al. B-crystallin mutation in dilated cardiomyopathy. BiochemBiophys Res Commun. 2006;342:379386.13Lange S, Auerbach D, McLoughlin P, et al. Subcellular targeting of metabolic enzymes to titin in heart muscle may be mediated by DRAL/FHL-2. J Cell Sci. 2002;115:49254936.14Yamasaki R, Wu Y, McNabb M, et al. Protein kinase A phosphorylates titins cardiac-specific N2Bdomain and reduces passive tension in rat cardiac myocytes. Circ Res. 2002;90:11811188.15Lee EH, Gao M, Pinotsi N, et al. Mechanical strength of the titin z1z2-telethonin complex. Structure.2006;14:497509.AassociatedstudyofmutationsofTTNanddilated cardiomyopathy in Chinese patientsLiu Xing, Rao Li, Zhou Bing, Zhang Beilei, Wang Yanyun, Chen Bin, Wu Yang, Huang PingDepartment of Cardiology, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu, China（610041）The West China College of basic and forensic medicine, Sichuan University, Chengdu, China（610041)AbstractObjective Four possible disease-associated mutations located in three exons(3,14,49) of titin gene(TTN) have been identified in Japanese DCM patients in 2002. We tried to establish the association between mutations of titin gene (TTN) and the occurrence of DCM in Chinese population. Methods Inthe present study，these three exons of TTN were screened in 117 DCM patients and 120 controls inChina by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphisms (PCR-SSCP), Polyacrylamide gel electrophoresis and DNA sequence. Results The mutations found in Japanese patients have not been identified in this study. A novel mutation was found in 2 patients (1.7%), who are sister and brother and have strong DCM family history, the G13053A (TTN cDNA sequence, X90568) change resulted in amino acid change at position 4351 (Gly4351Asp). No mutation was identified in controls. Conclusions It is for the first time we found a novel mutation Gly4351Asp in TTN in Chinese DCM patients, indicating that mutations in titin may be a significant portion of the genetic etiology in DCM, especially in early onset subgroup.Keywords: Dilated cardiomyopathy; titin; mutation; PCR-SSCP; DNA sequence表 1DCM 患者和健康对照组的临床特点比较 参数DCM 组对照组（n=117）（n=120）年龄（year）58 ± 1355 ± 11BSA(m2)1.71 ± 0.151.69 ± 0.16SBP (mmHg)117 ± 16115 ± 13DBP (mmHg)76 ± 8.874 ± 8.2HR (bps)94 ± 20*75 ± 9LA (mm)43.4 ± 6.5*31.2 ± 3.7IVSd (mm)9.2 ± 1.49.4 ± 1.1LVPWd (mm)9.2 ± 1.3*7.3 ± 1.0LVEDD (mm)68.6 ± 8.9*45.7 ± 4.6LVESD (mm)57.7 ± 12.5*26.3 ± 4.7LVFS (%)18.6 ± 6.6*38.7 ± 6.2LVEF (%)32 ± 5.6*63 ± 7注：BSA: 体表面积; SBP: 收缩压; DBP: 舒张压; HR: 心率; LA: 左心房; IVSd: 舒张末期室间隔厚度; LVPWd:舒张末期左心室后壁厚度; LVEDD: 左心室舒张末期直径; LVESD: 左心室收缩末期直径; LVFS:左心室（射血）分数缩短; LVEF: 左心室射血分数。HR、LA、LVPWd、LVEDD、LVESD、LVFS and LVEF 等参数在 DCM 组与对照组间存在明显差异。图 1：DCM 组 SSCP 电泳图，其中有差异的两个样本分别来自 12 岁的姐姐和 10 岁的弟弟。图 2：对照组 SSCP 电泳图未见异常电泳带。图 3：DNA 测序证实 DCM 患者第 49 外显子存在 G13053A 杂合突变图 4：DCM 组 SSCP 电泳图显示第 14 外显子未发现异常。图 5：对照组 SSCP 电泳图未见异常。图 6：DCM 患者第 14 外显子第 743 密码子未见突变。