人工蛹虫草中 N62羟乙基腺苷的分离.doc

精品论文人工蛹虫草中 N6-（2-羟乙基）腺苷的分离纯化及其对小鼠 lewis 肺癌细胞的增殖抑制 作用的研究5卢丽丽1，舒特俊1，陈剑清1，吴祥甫1，张耀洲1,2（1. 浙江理工大学生命科学学院生物化学研究所,杭州 310018；2. 天津市国际生物医药联合研究院，天津 300457）摘要：N6-（2-羟乙基）腺苷是第一个生物来源的钙离子拮抗剂，具有很强的抗紫外辐射、10抗血小板凝集和镇痛等效用。关于其抗肿瘤方面的作用报道很少。本研究采用水提醇沉、制 备液相分离和结晶等简单的方法，从蛹虫草水提取物中分离出了 N6-（2-羟乙基）腺苷。并利用小鼠 lewis 肺癌细胞为模型，采用 MTT 法对其体外抗肿瘤效果做了初步研究，发现它对小鼠 lewis 肺癌细胞具有较强的抑制作用，且此种抑制作用呈时间-剂量依赖效应。此为探 索和拓展 N6-（2-羟乙基）腺苷的其他功效提供了一定的借鉴作用。15关键词：生物化学；N6-（2-羟乙基）腺苷；蛹虫草；抗肿瘤中图分类号：Q58Study on the Isolution and Purification of20N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine from Cordyceps militaris and Its Inhitory Effect on the Lewis Lung CancerLU Lili1, SHU Tejun1, CHEN Jianqing1, WU Xiangfu1, ZHANG Yaozhou1,2(1. Institute of Biochemistry,College of Life Science,ZheJiang Sci-Tech University,HangZhou310018;252. TJAB TianJin 300457)Abstract:N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine is a kind of calcium antagonist of the first biological sources. It has strong resistance to UV radiation, and the effectiveness of anti-platelet aggregation and analgesic. Little is reported about its role in the anti-tumor. Method of water extraction and ethanol precipitation, preparative liquid chromatography and crystallization was used to isolate30and purify N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine in this study. MTT assay was used to preliminary investigated the inhibitory effect of N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine on tumor in vitro while the Lewis lung cancer was used as model. Result showed that N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine had a relatively strong inhibitory effect on Lewis lung cancer with a time-dose depend effect. This study provided a certain reference for the exploration and expansion of the function of35N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine.Key words: biochemisty; N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine; Cordyceps militaris; anti-tumor.0引言蛹虫草Cordyceps militaris (L.ex.Fr) Link，又名北冬虫夏草，蛹草，北虫草，蛹草菌等，40分类学上属于真菌门(Eumycota)，子囊菌亚门(Ascomycotinia)，核菌纲(Pyrenomycetes)，球壳 目(Sphaeriales)，麦角科(Claviciptiaceae)，虫草属(Cordyceps) 1。其与冬虫夏草同属异种， 是国内外公认的食药用真菌，民间用于肺炎、肾虚、腰痛等疾病的治疗2。研究表明蛹虫草基金项目：国家高技术研究发展计划“863”项目（2011AA100603） 作者简介：卢丽丽(1987-),女,研究生,生物化学与分子生物学 通信联系人：张耀洲(1964-),男,教授,家蚕生物反应器. E-mail: yaozhou- 8 -具有与冬虫夏草极相似的作用，无毒副作用，可以作为冬虫夏草的代用品3，其在药用价值 方面有着巨大的开发潜力。蛹虫草中含有多种药理学活性成分，包括核苷类物质，多糖，甾45醇类及肽类等。N6-（2-羟乙基）腺苷是一种腺苷衍生物，是虫草的特有成分，已成为虫草制品的质量 控制指标之一4。它是第一个生物来源的钙离子拮抗剂5，具有很强的抗紫外辐射、抗血小 板凝结和镇痛等效用6，是集医药保健、化妆品和生物防治多项开发潜力于一身的生物资源 7，但其在抑制肿瘤生长方面的作用报道很少。本研究利用水提醇沉、制备液相和结晶等简50单的方法，从人工蛹虫草中分离纯化出了 N6-（2-羟乙基）腺苷，并利用小鼠 lewis 肺癌细 胞为细胞模型，对其在体外抗肿瘤方面的作用做了初步探索。551仪器与试剂图 1 N6-(2-羟乙基)腺苷Fig. 1 Chemical structure of N6-(2-Hydroxyethyl)-Adenosine1.1材料小鼠 lewis 肺癌细胞，由南开大学馈赠；人工蛹虫草，由本实验室培育。1.2仪器AKTA Exploer，够于 GE 公司； 旋转蒸发仪，购自上海亚容生化仪器厂；台式冷冻离60心机，购自 Thermo 公司；YMC-Pack ODS-A 反相色谱柱，购自博纳艾杰尔公司；二氧化碳 培养箱，购自 RS Biotech 公司；倒置光学显微镜，购自日本尼康公司；全波长酶标仪， 购自 Thermo 公司。1.3试剂甲醇为色谱纯，购自 Honeywell 公司；无水乙醇，够自天津市北方天医化学试剂厂；65DMEM 无血清细胞培养基，购自北京 Thermfisher 科技生物制品有限公司；胰蛋白酶购自 Roche 公司；细胞培养用青霉素和链霉素、胎牛血清（FBS）购自 Invitrogen 公司；苔盼兰购自北京西美杰科技有限公司；MTT 购自 Solarbio 公司； DMSO，分析纯，购自天津市北方天医化学试剂厂。2实验与方法702.1N6-（2-羟乙基）腺苷的制备2.1.1N6-（2-羟乙基）腺苷的分离与纯化蛹虫草粗提物的制备称取 500 g 蛹虫草超微粉碎粉末，分别加水 8 倍，4 倍和 3 倍对其进行 3 次连续煎煮提取，每次煎煮 30 min，水沸腾时开始计时。煎煮提取结束后室温下 6000 rpm 离心 30 min，75收集合并上清液。上清液经旋转蒸发仪浓缩至适量，边搅拌边向浓缩液中加入 95%的乙醇， 至乙醇终浓度为 80%，4静置，沉淀过夜。收集乙醇上清液，上清液经旋转蒸发仪浓缩回 收乙醇后，转移至 60恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。2.1.2N6-（2-羟乙基）腺苷的分离与纯化 将干燥至恒重的乙醇上清液用流动相（15%甲醇-水溶液）配制成 100 mg/ mL 的溶液，80经制备液相进行分离。分离条件为：流动相为 15%甲醇-水溶液，监测波长为 260 nm，流速为 10 mL/min。制备液相所得色谱图见图 2，收集图 2 中的最后一个峰。分离结束后，使用 旋转蒸发仪浓缩最后一个峰的收集液，4结晶，得白色结晶形固体。图 2 制备液相色谱图85Fig. 2 Chromatogram of preparative liquid chromatography2.1.3N6-（2-羟乙基）腺苷的鉴定采用 ESI-MS，NMR 和 IR 技术鉴定 N6-（2-羟乙基）腺苷。2.2MTT 法检测 N6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞的生长抑制作用2.2.1细胞培养90小鼠 lewis 肺癌细胞用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，于 37、5%CO2 培养箱中培 养。每 23 天换一次培养液，常规胰酶消化传代。2.2.2细胞毒性检测（MTT 法）1）采用 MTT 法检测 N6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞的抑制效果，实验设 置空白对照组（只含培养液），阴性对照组（含细胞和相应量的溶剂），实验组，阳性药物95（虫草素）组。每组设 3 个复孔。2）取处于对数生长期，生长状态良好的细胞，将细胞进行常规胰酶消化后制备成细胞 悬液，用血细胞计数板计数，调整细胞浓度为 2.5×104 个/mL，96 孔板中每孔接入 90 L 的100105110115120125细胞悬液。结束后，将细胞于 37，含 5% CO2 的培养箱中培养 24 h，使细胞充分贴壁。3）细胞贴壁后，向实验组中加入 10 L 事先配制好的不同浓度的 N6-（2-羟乙基）腺苷 溶液，使 N6-（2-羟乙基）腺苷的终浓度为 400 g/mL，200 g/mL，100 g/mL，50 g/mL，25 g/mL，和 12.5 g/mL。阴性对照组中加入 10 L 的无菌水，阳性对照组虫草素的终浓度 分别为 12.5 g/mL ，25 g/mL，50 g/mL 和 100 g/mL。细胞继续于 37，含 5%的 CO2 培养箱中分别培养 24 h，48 h 和 72 h。4）培养结束后每孔加入 10 L 5 mg/mL 的 MTT 溶液，37继续培养 4 h 后，小心吸取 弃掉培养液，每孔再加入 150 L 的 DMSO，室温下于蜗旋混合器上振荡 10 min，以充分溶 解紫色结晶物质。5）于酶标仪下测定 570 nm 处的 OD 值，630 nm 处校正。按下列公式计算 N6-（2-羟乙 基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞的抑制率：抑制率（%）=（实验组 OD 值-阴性组 OD 值）/(阴性组 OD 值-空白组 OD 值)×100。6）数据结果采用 SPSS 13.0 进行分析。3结果与分析3.1N6-（2-羟乙基）腺苷的鉴定化合物经 ESI-MS，NMR 和 IR 鉴定，结果见图 36。经结构解析，确定所得白色结晶 形粉末为 N6-(2-羟乙基)腺苷。解析结果如下：正离子模式电喷雾质谱(+)-ESI-MS给出准分子离子峰 m/z 为： 311.97 M+H+；提示 分子组成为 C12H17N5O5。1D 1HNMR 谱中(DMSO-d6, 400 MHz)的数据结果如下：8.358(1H, s,H-8)，8.216(1H，s，H-2)，7.699(1H，brs，N6H)，5.882(1H，d，J=6.3 Hz，H-1)，5.447(1H，d，J=6.3 Hz, 2-OH)，5.416(1H，dd，J=6.9，4.7 Hz，5-OH)，5.189(1H，J=4.7 Hz，3-OH)，4.769(1H，brs，OH-2)，4.605(1H，dd，J=11.3，6.0 Hz，H-2)，4.148(1H，m，H-3)，3.959(1H，dd，J=6.6，3.6 Hz)，3.665(1H，dt，J=12.1，3.9 Hz，Ha-5)，3.573(4H，brs，H-1”, 2”)1D 13CNMR 谱中(DMSO-d6, 400 MHz)的数据结果如下：155.19(C-6)，152.77(C-2)，148.75(C-4)，140.25(C-8)，120.27(C-5)，88.40(C-1)，86.36(C-4)，73.94(C-2)，71.11(C-3)，62.13(C-5)，60.14(C-2”)，42.95(C-1)。IR 谱中：cm-1，3419.86(NH)，3305.66，3268.83，3151.46(OH)，1626.34(C=N)，参照 文献8报道的数据，鉴定化合物为 N6-(2-羟乙基)腺苷。130135图 3 化合物的 ESI-MS 结果Fig. 3 ESI-MS spectrum of compound图 4 化合物的 13CNMR（DMSO-d6, 400 MHz）谱图Fig. 4 13CNMR (DMSO-d6, 400 MHz ) spectrum of compound图 5 化合物的 1HNMR（DMSO-d6, 400 MHz）谱图Fig. 5 1HNMR (DMSO-d6, 400 MHz ) spectrum of compound1403.2细胞毒性试验结果图 6 化合物的 IR 结果Fig. 6 IR spectrum of compound145150实验用 12.5 g/mL，25 g/mL，50 g/mL，100 g/mL，200 g/mL，400 g/mL 的 N6-（2-羟乙基）腺苷作用于小鼠 lewis 肺癌细胞，经过 24 h、48 h、72 h 的培养后，采用 MTT法分析了药物对小鼠 lewis 肺癌细胞的生长抑制效果。结果见表 1 和图 7，结果显示，N6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞具有细胞毒作用，此种作用呈现剂量-时间依赖效应。 采用 SPSS 13.0 计算半数抑制浓度的结果见表 2，表 2 显示，当作用时间为 72 h 时，N6-（2- 羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞半数抑制浓度为 48.49 g/mL。显示 N6-（2-羟乙基）腺 苷对小鼠 lewis 肺癌细胞具有较强的抑制作用，能够明显抑制细胞的生长。表 1 N6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞的增殖抑制效果Tab. 1 Inhibitory effect of N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine药物药物作用浓度g/ml24 h 抑制率%( x ± s )%48 h 抑制率%( x ± s )%72 h 抑制率%( x ± s )%6.2512.5255.32±3.9711.54±4.5122.55±0.348.43±2.8817.79±0.0330.17±3.1711.33±2.4623.29±2.7837.63±1.33N6-（2-羟乙基）腺苷5032.95±5.3943.75±6.9451.19±2.9710047.51±4.2459.11±0.2167.87±3.2820062.91±4.8967.17±4.7975.47±2.2940082.39±2.9477.37±3.9987.29±0.73阳性对照（虫草素）12.527.19±1.2239.13±1.9754.04±5.792522.55±0.3430.17±3.1737.63±1.335079.95±0.0588.23±0.9292.87±1.7710089.01±1.7992.57±0.6799.58±1.62N6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠lewis肺癌细胞的增殖抑制作用120100抑制率%80604020024 h48 h72 h浓度 g/ml155图 7 N6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞的增殖抑制效果Fig. 7 inhibitory effect of N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine表 2 不同作用时间的半数抑制浓度 IC50Tab. 2 IC50 of different time药物作用时间 hIC50 值 g/mL1604小结与讨论24105.164876.047248.49165170药物的体外细胞筛选是常用的研究手段，稳定、方便、经济；可研究药物作用的靶位； 时间、剂量等条件的稳定可控性；能够快速区分药物的体内间接作用与直接作用等优点使体 外筛选成为药物活性成分筛选的重要组成部分。体外筛药方法诸多，MTT 法以其快速，简 便，处理量大的优点被广泛用于体外抗肿瘤药物的筛选。研究应用水提醇沉，制备液相，结晶等简单的方法，从人工蛹虫草子实体中分离纯化出 了 N6-（2-羟乙基）腺苷，并采用 MTT 法初步分析了 N6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺 癌细胞的增殖抑制效果。结果显示 N6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞具有较强的 生长抑制作用，且抑制作用呈现出时间-剂量依赖效应。此为 N6-（2-羟乙基）腺苷功能的开 发提供了一定的借鉴作用。但是实验仅以小鼠 lewis 肺癌细胞为研究对象，无法全面的反映 N6-（2-羟乙基）腺苷的体外抗肿瘤情况。因而需要继续使用多种细胞进行体外筛选，同时 结合体内抗肿瘤实验，综合评估 N6-（2-羟乙基）腺苷的抗肿瘤效果。参考文献 (References)1751801851 邵力平.真菌分类学M.北京：中国林业出版社，1984,109.2 钟石，计东风，陈诗，胡桂燕，李有贵.蛹虫草研究进展J.蚕桑通报，2006,37（4）：6-10 3 徐锦堂.中国药用真菌学M.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1997.4 徐红娟，莫志宏，余佳文，朱华李，毛先兵.蝉花生物活性物质研究进展J.药学专论，2009,18（4）：19-215 Furuya T,Hirotani M.Matsuzawa M.N6-(2-hydroxyethyl) adenosine,a biologically active compound from cultured mycelia of Cordyceps and Isaria SpeciesJ.Phytochemistry,1993,22(11):2509-2512.6 柴一秋，韦忠民，陈祝安，厉晓腊等.N6- （2- 羟乙基）腺苷在制备镇痛药物中的应用P. 中国，ZL200410094511.0.2006-11-8.7 梁宗琦,2007.中国真菌志M.北京：科学出版社，2007.8 吕子明，姜永涛，吴立军. 人工蛹虫草子实体化学成分研究J. 中国中药杂志，2008，33（24）：2914-2917.