【SN商检标准】snt 1129.12002 牛病毒性腹泻粘膜病病毒微量血清中和试验操作规程.doc

Protocol of serum neutralization micro test for bovine viral dmiuacrorshaeladiseaseSNT 1129.1 2002前言本标准试验方法是参考国际兽疫局诊断试验和疫苗标准手册介绍的方法，并经过长期实践、改进，使之进一步具体化，而形成现行的标准。 本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：张晓丁、苏卫、王涛、李凌枫。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1 范围 本标准规定了牛病毒性腹泻粘膜病微量血清中和试验方法。 本标准适用于动物牛病毒性腹泻粘膜病中和抗体的检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期时引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用 于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6681 99分析实验室用水规格和实验方法3 缩略语下列缩略语适用于本标准。CPE细胞病变作用。TCID50半数组织培养感染量。BVDMD牛病毒性腹泻粘膜病。4 原理 动物感染BVD后，能在体内产生特异性中和抗体。这种特异性中和抗体与病毒结合后，能使病毒失去对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应的免疫血清所中和，而且还表现中和一定数量的病毒，必须有一定效价的免疫血清。血清中和试验以测定病毒的感染力为基础，中和抗体滴度的判定以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，所以必须选用对病毒敏感的细胞为实验材料，以保证实验的准确性和敏感性。5 试剂和材料5.1 水本标准所用水应符合GBT 6681992中二级水的规格。5.2 病毒BVD病毒Oregon2C4V株。牛病毒性腹泻粘膜病病毒微量血 清中和 试验 操作 规程5.3 对照血清5.5 细胞5.4 被检血清 在无菌条件下采取血样，分离血清。胞。按常规胰酶消化方法制备(所用犊牛应无BVD污染)。5.6 本标准所用溶液 配方(包括培养液、维持液、稀释液、细胞分散液)及配制方法见附录A。6 器械和设备6.1 倒置光学显微镜6.2 微型振荡器6.3 二氧化碳培养箱6.4 冰箱：-20保存血清，-70保存种毒。6.5 9组织培养板6.6 单头和多头微量移液器(20L200L)及滴头7 种毒繁殖将BVD病毒Oregon2C4V株接种到细胞单层，37吸附1后h 加入维持液，置37培养，逐日观察。待CPE达75以上，收获病毒培养物冻融，2000r min离心20 mi。取上清液分装小瓶，每瓶1 m，置-70保存备用。8 毒价测定将病毒在96孔板上作(10010-10)倍稀释，每个稀释度接种8孔，每孔病毒悬液为50L，补充50 L稀释液，加入细胞悬液100L(3×105个细胞mL)，每块板设8孔细胞对照。置5C02培养箱于37培养，于4d 6逐d 日在倒置显微镜下观察记录CPE。按Karber方法计算出病毒的TCID5050L值。根据测定结果将病毒液稀释成100 TCI5D050L的工作浓度。9 试验程序9.1 灭活BVD标准阳性血清、阴性血清、被检血清经56，30 mi 活。9.2 对照设立细胞对照：设4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液100L、稀释液100L。病毒回归对照：将工作浓度的病毒液进一步10倍稀释成100、10、1、0.1 TCI5D050L，每个稀释度接种2孔，每孔加入病毒悬液50 L，再加 入细胞悬液100L，每孔补充稀释液50L。阳性对照：设4孔阳性血清对照，每孔分别加入阳性血清和100 TCI5D050L病毒悬液各50L，再加入细胞悬液100L。阴性对照：设阴性血清对照4孔，每孔分别加入阴性血清和100 TCI5D050L病毒悬液各50L，再加入细胞悬液100L。血清毒性对照：每份被检血清按稀释度各设1孔毒性对照，每孔加各稀释度血清50L、稀释液50 L和细胞悬液100L。9.3 中和试验 根据试验需要，将被检血清从1：2开始作倍比系列稀释，每个稀释度加三孔，每孔加已稀释血清50L，第一孔作为血清毒性对照孔，加入稀释液50L和细胞悬液100L；第二、三孔为试验孔，每孔加入100 TCID。5 50 L的病毒悬液50L，振荡2 mi3 mi，置37二氧化碳培养箱中和l ，h然后加入细胞悬液100L。置5二氧化碳培养箱于37培养6，d 逐日观察CPE并记录。10 结果判定当病毒对照滴度为100(30300)TCID5050L时，阳性血清能完全抑制BVD病毒的CPE，阴性血清完全不能抑制BVD病毒的CPE，细胞对照孔和血清毒性对照孔内的细胞生长正常时，才能进行结果判定。判定时间为4溶液配制清的稀释度即为该份血清的中和抗体滴度。d 6，d 逐日记录CPE。当被检血清的某一稀释度出现50以上被保护时，该血试验所用的细胞为牛鼻甲骨传代细胞(BT)、胎牛(或犊牛)鼻甲骨原代细胞、牛肾传代细胞(MDBK)、胎牛(或犊牛)肾原代细胞、胎牛或犊牛睾丸细附录A (规范性附录)199培养基(也可用MEM或其他培养基)，加入10无BVD病毒抗体胎牛血清(56，30 mi菌。置-20保存备用。A.2 维持液199培养基(也可用MEM或其他培养基)，加入2无BVD病毒抗体胎牛血清(56，30 mi菌。置-20保存备用。A.3 细胞分散液胰酶2.50 g 乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 0.20 g 无钙镁离子PBS液1 000 mL 抽滤除菌分装，置-20保存备用。A.4无钙镁PBS氯化钠8.0 g 氯化钾0.2 g 磷酸氢二钠1.15 g 磷酸二氢钠0.2 g水1 000 mL活)，含青霉素200 I活)，含青霉素200 ImL，链霉素200gmL，抽滤除mL，链霉素200gmL，抽滤除将上述成分依次溶解、分装、高压灭菌(68.94 kPa 15 m或in抽) 滤除菌，置4保存备用，有效期为一年。A.5 Hank'液sA.5.1 1倍0 Hank's母液的制备A液：氯化钠80.0 g 氯化钾4.0 g 氯化钙1.4 g 硫酸镁(7H20)2.0 g水450 mL液B ：磷酸氢二钠0.6 g磷酸二氢钾0.6 g水450 mL液C ：1酚红16 mL将上述成分依次溶解，将B液慢慢加到A液中，同时不断搅拌，再加入C液，补充水至1 0004保存备用，有效期为3个月。A.5.2 Hank'使s 用液的制备10倍Hank's母液500 mL一级水4500 mL。mL抽滤除菌或高压灭菌(103.41 kPa 10 m。in置)A.1 培养液将母液加到水中，摇匀分装。抽滤除菌或高压灭菌(103.41 kPa 10 m。in置) 4保存备用，有效期为3个月。使用前每1 00025 m。L加mL1.4碳酸氢钠A.6 1.4碳酸氢钠溶液碳酸氢钠14.0 g一级水1 000 mL分装抽滤除菌，置-20保存备用，有效期为6个月。A.7 1酚红酚红1.0 g1 mol/L NaOH 约7 mL水总量到100mL将酚红放于乳钵内加少量1 molL氢氧化钠研磨使其完全溶解，氢氧化钠加得越少越好，分装高压灭菌(68.94 kPa 10 mi，n)置室温或4保存 备用。A.8 消化液(0.25胰酶Trypsin) 胰酶2.5 g Hank's使用液1 000 mL 分装抽滤除菌，置-20保存备用。