亲和层析原理和步骤.ppt

亲 和 层 析Affinity Chromatography,一、原理,亲和层析是利用生物大分子所具有的专一亲和力而设计的纯化技术 寻找配基配基固定化制成亲和层析柱,基本过程,固相化,吸附,解吸,载体,酶：基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗原，病毒，细胞细胞：细胞表面特异蛋白，外源凝集素核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶 激素或药物：受体，载体蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞,常见具有专一性亲和力的生物分子对：,（一）载体的选择,1、载体要求：（1）不溶性（2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液 体流动性（3）化学和机械性能稳定（4）具备大量能被活化的基因（5）抗微生物和酶的侵蚀,2、常用载体（1）纤维素 特点：价廉、来源充足 纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化,（2）葡聚糖凝胶特点：化学及物理性质稳定 多孔性比琼脂糖低,（3）琼脂糖凝胶,浓度 商品2%Sepharose 2B 4%Sepharose 4B 6%Sepharose 6B,凝胶浓度越低结构越疏松机械强度越低,（4）聚丙烯酰胺凝胶,（5）多孔玻璃特点：不受微生物的侵蚀 耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附,特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的酰胺基较多,（二）配基的选择,1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力2、必须具备能被修饰的功能基团,以酶和底物为例：,E+L ELKL=EL/EL=E0-ELL0-EL/ELE0、L0：起始浓度当L0E0时KL=E0-ELL0/ELEL=E0-ELL0/KLKd=结合酶/游离酶=EL/E0-EL=L0/KL,KL,KL：解离常数 E：酶 L：底物EL：复合物,（三）固相化将配体以共价键连接于固相基质上制成固相化吸附剂,载体的排斥效应载体的空间障碍,二、亲和层析分离,1、装柱和平衡2、上样、亲和吸附3、洗脱,无效洗脱,吸附效率不高,有效吸附,洗脱方法（1）非特异性洗脱：改变洗脱液pH值离子强度梯度洗脱（2）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键（3）专一性洗脱,已使用过和柱，经过再生处理，去除非特异吸附的杂质后，可重复使用 再生步骤：起始缓冲液重复平衡一次用高离子强度和低离子强度溶液处理用弱酸或弱碱溶液处理,4、亲和柱的再生：,三、特点,1、一步纯化步骤2、产物非常纯3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质4、可去除已变性或部分降解物质,四、应用,1、分离和纯化2、分辨化学或遗传学上修饰的酶3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质 结构研究4、纯化人工合成的多肽和蛋白质5、解释酶作用机理,载体,实验亲和层析法分离豌豆凝集素,