ELK1 结合位点突变的 EGR1 启动子报告载【推荐论文】 .doc

精品论文ELK1 结合位点突变的 EGR1 启动子报告载体的构建和鉴定熊毅1,2,3，张惠华1,2,3，吴国艺1,2,3，董濠鋆1,2,3，陈小佳1,2,35（1. 基因工程药物国家工程研究中心；2. 广东省生物工程药物重点实验室；3. 暨南大学细胞生物学系/生物医药研究院，广州 510632 ）10摘要：EGR1 一个普遍存在于哺乳动物细胞中的核转录因子，具有调节细胞生长、增殖和分 化发育的功能。本文采用重叠 PCR 法成功构建 EGR1 启动子片段中 ELK1 结合位点突变的 载体，利用荧光表达系统对重组载体活性进行分析。以已构建的人 EGR1 启动子载体为模板， 在引物上引入突变碱基，重叠 PCR 扩增获得突变启动子序列，经过 T 载体亚克隆入 pGL3-basic 荧光表达载体，获得重组突变载体 pGL3-EGR1mt，以 pRL-TK 为内对照载体，15共转染 293 细胞，分别检测报告载体的荧光素酶活性；结果表明，转染了重组突变载体的细 胞的荧光素酶活性明显比未突变组低。本实验获得的重组突变载体为进一步研究 EGR1 对下游信号通路的影响奠定了基础。关键词：分子生物学；EGR1 启动子；重叠 PCR；点突变；荧光素酶报告系统中图分类号：Q78; Q29120Reconstruction and identification of EGR1 promoter report vector with ELK1 binding site mutationXIONG Yi1,2,3, ZHANG Huihua1,2,3, WU Guoyi1,2,3, DONG Haojun1,2,3, CHEN Xiaojia1,2,325(1. National Engineering Research Center of Genetic Medicine;2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Bioengineering Medicine;3. Cell Biology department & Institute of Biomedicine of Jinan University, Guangzhou 510632, China)Abstract: The early growth response 1 (EGR1) is a nuclear transcription factor which regulates30cell proliferation, differentiation and apoptosis. To further explore its function, a recombinant luciferase reporter vector of EGR1 promoter with ELK1 binding site mutation was constructed. By using overlap PCR assay, the EGR1 promoter sequence with ELK1 binding site mutation was obtained. Then, the targeted sequence was subcloned into pGL3-basic vestor to be named of pGL3-EGR1mt. Co-transfected with pRL-TK vector as internal control reporter, luciferase35activities expressed in 293A cells transfected with pGL3-EGR1mt and pGL3-EGR1 had been compared. The results showed that a decrease in cell transfected with pGL3-EGR1mt. In conclusion, a mutated EGR1 promoter with lower luciferase activity was successfully gained forfuther investigation.Key words: Molecular biology; Egr1 promoter; overlap PCR; site mutation; luciferase reporter40system0引言ERG1(early growth response 1)属于即刻早期基因家族中的一员1 ，位于人类染色体5q31，由 533 个氨基酸组成的分子量为 75kD 的蛋白质 2。EGR1 作为一个重要的核转录因子，基金项目：广州市科技计划项目基金（2010J-E261）作者简介：熊毅（1988-），男，硕士，分子与细胞生物学通信联系人：陈小佳（1973-），女，助理研究员，分子与细胞生物学. E-mail: tchenxj- 7 -45它含有一个高度保守的 DNA 结合域，能与富含 GC 序列 GCGC(G/T)GGGCG 3结合，调控基因的 表达。EGR1 启动子上同时存在多种转录因子结合位点，包括血清反应元件 SREs、AP-1 结合位点、cAMP 调控元件 CREs 和 SP1 结合位点等 4。EGR1 在不同细胞类型或外因刺激下，可结 合到目的基因启动子上的富含 GC 的顺式作用元件起到转录激活作用，促进细胞的分化、生长、生长抑制和凋亡5。50ELK1（ETS-like protein 1）为真核细胞转录因子ETS家族中的重要成员，早在1989年Rao 等研究发现了两个新ETS致癌基因，并将其命名为ELK1和ELK26。ELK1活性受磷酸化与去磷 酸化影响，其表达与上游MAPK信号通路有关，包括Erk1/2、p38及JNK信号通路的激活7，磷 酸化ELK1通过与DNA直接结合而起到转录激活作用8。研究显示转录因子ELK-1 的磷酸化 可能是恶性肿瘤发生发展的重要环节及细胞侵袭转移的调控通路9。通过UCSC基因组数据库55（UCSC Genome Browse Database）软件分析，在已获得的EGR1启动子（-669+157）中含有3个ELK1结合位点, 并有研究指出，ELK1 C-末端的的磷酸化可改变其蛋白构象，有利于与EGR1启动子的结合，介导后者的表达上调10。本文旨在通过将 EGR1 启动子中-401bp 处 ELK1 结合位点（cccgccggaacaac）突变，构 建启动子突变的 pGL3-basic 荧光表达载体，通过启动子荧光素酶活性检测，探讨 ELK1 与60EGR1 的表达调控关系，并为 EGR1 在癌症治疗方面的机制和功能的研究打下实验基础。1材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂65大肠杆菌 DH5 、293A 细胞为本实验室保存。pGL3-basic 载体、pRL-TK 载体、内切 酶 Xho、Hind 、pMD18-T 载体均购至 Takara 公司，KOD-Neo-Plus 高保真酶、LigationHigh购至 TOYOBO 公司， 2XLA Taq Mix 、 DNA marker 购至 广 州 东 盛 生 物 公 司 ， Lipofectamine2000 转染试剂购至 Invitrogen，双荧光素酶报告系统购至 Promega 公司，质粒 提取试剂盒、胶回收试剂盒购至 Omega 公司。701.1.2引物设计与合成参考 UCSC 收录的 EGR1 启动子序列，利用文献报道和软件预测出 ELK1 结合位点（cccgccggaacaac），使用 Primer Primer 5.0 设计重叠 PCR 特异性引物。上游引物：5-A TCGCTCGAGGGGCCCTGGATGACAGCGAT- 3（含有 Xho酶切位点，划线部分），上 游重叠引物：5- AATAAGGGTTGTGAAGGCGAGGGATCCTTCC - 3，扩增长度为 264bp；75下游重叠引物：5- GGAAGGATCCCTCGCCTTCACAACCCTTATT -3，下游引物：5-ACCCAAGCTTAACACTGAGAA GCGTGCAGGC- 3（含有 Hind 酶切位点，划线部 分），扩增长度为 641bp，总长度为 846bp。1.2方法1.2.1PCR 扩增80模板为已构建好的转载在 pGL3-basic 上的 EGR1 启动子序列（-669+157）pGL3-EGR1， 由本研究小组构建。PCR 反应分为两步，第一步体系 25 L，模板 1 L，10xbuffer 2.5 L，MgSO41.5 L，dNTP 2.5 L，KOD-Neo-Plus 0.5 L，上游引物（下游引物）/上游重叠引物（下游重叠引物）分别为 0.75 L，3dH2O 15.5 L。9630s，5930s，7240s，32 循环。 扩增产物纯化后，进行第二步。体系 10 L，上、下游纯化产物各 0.5 L，2xTaq Mix5 L，854 L 3dH2O。9630s，5130s，7260s，12 循环。反应完成后，各补加 2xTaq Mix5 L，1 L 3dH2O，上游引物和下游引物各 2 L。9630s，53.530s，7260s，32 循环。1.2.2重组表达载体的构建PCR 扩增产物经纯化，根据 A-T 克隆法，直接跟 T 载体进行连接。重组质粒转化感受 态 E.coli DH5 ,在 LB 培养基上选择浅色（接近无色）菌落，液体培养，抽提重组质粒，酶90切、PCR 验证插入片段的大小，测序。序列正确的重组子抽提质粒，亚克隆到 pGL3-basic上，酶切、PCR 鉴定，获得 pGL3-EGR1mt。1.2.3脂质体法转染 293A 细胞对数生长期的 293A 细胞计数后，按 1×106 细胞/孔，种于 24 孔板内，待细胞融合度 为 60%时，进行质粒转染。按 4µg DNA，5µL LipofectamineTM 2000 介导转染细胞，以共95转染 pGL3-EGR1、pRL-TK 和 pGL3-EGR1mt、pRL-TK 为实验组，转染 pGL3、pRL-TK 为 对照组，48h 后，收集细胞。1.2.4双荧光素酶报告实验每孔细胞加入 150 L 的 PLB，室温轻微振摇 30min，收集细胞裂解液于干净的 EP 管 中；在白色不透光的 96 孔板中加入 50 L 的 LAR；将细胞裂解液 12，000g 离心 1min，100取上清 25 L 加入孔中并吹打均匀；用阅读仪测量可见光强度 10（s此时所读的光为 pGL 载体上转录翻译产生的萤火虫荧光素酶所发出的）；继续在孔中加入 50 L Stop and Glo Reagent，吹打均匀；用阅读仪测量可见光强度 10s（此时所读的光为内参 pRL-TK 载体上 转录翻译出的海肾荧光素酶所发出的）；将所得到的数据，标准化后进行分析。1052结果1102.1EGR1 启动子突变序列的获得对带有突变碱基的引物进行重叠 PCR，以原有的启动子片段为模板，得出分别为 305bp 和 596bp 的扩增片段；将得到的扩增片段作为模板进行重叠 PCR，获得全长为 846bp 的含有 突变碱基的启动子片段（图 1A），将所获得 EGR1 启动子突变序列与原始 EGR1 启动子序列 同时进行测序，测序结果比对分析（图 1B、C），成功获得 ELK1 结合位点突变 EGR1 全长启 动子序列。图 1 突变 EGR1 启动子序列的获得和测序鉴定115120125130A.突变 EGR1 启动子 PCR 结果, B.原始序列测序, C.突变后序列测序图M: 100bp DNA 标准; 1: 596 bp 片段; 2: 305 bp 片段; 3: 846bp 全长突变片段.Fig.1 PCR and sequencing result of mutant EGR1 promoterA. PCR screening for mutant fragment, B. Origin sequence before mutant, C. Sequencing for mutant fragmentM: 100bp ladder DNA marker; 1: 596 bp fragment; 2: 305 bp fragment; 3: 846bp total mutant fragment.2.2pGL3-EGR1mt 重组载体的构建采用 A-T 克隆法，先把回收纯化后的目的片段连接到 pMD18-T 载体，转化大肠杆菌 DH5 ，挑取单菌落，Xho、Hind 双酶切及菌落 PCR 对所得阳性克隆进行鉴定，结果表明， 目的片段成功转入 pMD18-T 载体（图 2A）。对构建好的重组质粒 pMD18-T-EGR1mt 与表达载体 pGL3-basic 均使用 Xho、Hind 双 酶切，酶切产物回收后连接转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，菌落 PCR 鉴定，并使用限制性内切酶 Xho、Hind 双酶切进行验证（图 2B），成功获得重组表达载体，并命名为pGL3-EGR1mt。pGL3-EGR1mt 重组载体多克隆位点下游含有萤火虫荧光素酶编码区域，荧光 素酶表达量的高低直接反映启动子活性(图 2C)。图 2 pGL3-EGR1mt 重组表达载体的构建A. pMD18-T-EGR1mt 重组 T 载体的构建, B. pGL3-EGR1mt 载体的构建, C. pGL3-basic 载体图谱M1: DS5000 DNA 标准; M2: Hind DNA 标准; M3: DS2000 DNA 标准; 1:pMD18-T-EGR1mt; 2、3:pMD18-T-EGR1mt 双酶切、PCR 结果; 4: pGL3-basic; 6: pGL3-EGR1mt; 5、7: pGL3、pGL3-EGR1mt 双酶切;8: pGL3-EGR1mt PCR135140Fig.2 Construction of recombinant pGL3-EGR1mtA. Construction of pMD18-T-EGR1mt, B. Construction of pMD18-T-EGR1mt, C. Map of pGL3-basic vectorM1: DS5000 DNA Marker; M2: Hind DNA marker; M3: DS2000 DNA marker; 1:pMD18-T-EGR1mt; 2、3: pMD18-T-EGR1mt digested with Xhoand Hind and PCR result; 4:pGL3-basic; 6: pGL3-EGR1mt; 5、7: pGL3 and pGL3-EGR1mt digested with Xhoand Hind ; 8: PCRof pGL3-EGR1mt1451501551602.3突变启动子活性检测以带有绿色荧光蛋白 pEGFP-N1 载体转染 293A 细胞。摸索细胞最佳转染效率。 实验设 计 3 个浓度梯度，分别是 pEGFP-N1：lipo2000( g: ml)=4:10；4:5；2:5，转染 24h 后， 倒置荧光显微镜（IX71, Olympus Co.）观察拍照。结果表明（图 3），质粒与 lipo2000 最 佳转染效率为 4:5。pGL3-basic 载体含有荧光素酶报告基因，可用来检测基因启动子活性。用 4ug 质粒作 转染，pGL3-basic 和 pRL-TK 比例为 50:1。转染 pGL3-basic 和 pRL-TK 为对照组，将 pGL3-EGR1 和 pGL3-EGR1mt 分别与内对照载体 pRL-TK 共转染 293A 细胞。48h 后收集样品对 EGR1 启动 子活性检测。EGR1 启动子上 ELK1 结合位点经突变后，其启动子活性比原始启动子序列启动 子活性显著降低, p<0.05（图 4）。图 3 pEGFP-N1 转染 293A 细胞的荧光检测A. pEGFP-N1: lipo2000 ( g: ml) = 2: 5, B. pEGFP-N1: lipo2000 ( g: ml) = 4: 5, C. pEGFP-N1: lipo2000 ( g: ml) = 4: 10Fig.3 Fluorescent detection of 293A cells transfected with pEGFP-N1A. pEGFP-N1: lipo2000 (g: ml) = 2: 5, B. pEGFP-N1: lipo2000 (g: ml) = 4: 5, C. pEGFP-N1: lipo2000 (g: ml)= 4: 10165170175180185图 4 突变启动子活性检测(“*”表示 p<0.05)Fig.4 Dual luciferase activity assay of mutant promoter (“*” represents p<0.05)3讨论与结论EGR1 最早是作为调控细胞生长和增殖的因子被发现11，EGR1 可促进细胞从 G0/G1 期 进入 G2/M 期12。高表达 EGR1 能稳定染色体和抑制增殖，也可以促进分化和细胞凋亡；并 能直接调控一系列的肿瘤抑制因子、转录因子、生长因子及其受体等的表达，形成下游信号 网络决定细胞命运13。研究表明在结肠癌14、黑色素瘤15、乳腺癌16、前列腺癌17等多 种疾病中 EGR1 都扮演着重要角色，具有促进肿瘤发展的作用，预示 EGR1 可作为肿瘤基因治 疗中重要的分子靶点。ELK1是转录因子ETS家族、三元复合因子（TCF）亚族的一员。ELK1通过与ELK4/SAP-1 和ELK3/SAP-2/Net结合形成三元复合物，发挥调控基因转录的作用18。通过启动子结合位 点的软件的分析，EGR1（-669+157）启动子区含有三个ELK1的结合位点，提示ELK1作为转 录因子，对EGR1的表达可能发挥着重要的调控作用。体外实验研究证实，磷酸化的ELK1可与 EGR1启动子结合，直接介导EGR1的表达19-20。重叠延伸 PCR 在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以 及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用21。通过采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重 叠拼接起来.此技术利用 PCR 技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化 和连接酶处理，利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。本实验中所采用的双荧光素酶报告系统常用于实验系统中作相关的或成比例的检测 22，通常一个报告基因作为内对照，使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双 报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因 作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子，研究调控基因的结构和生 理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成190195200205210215220225230235240型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照，使测试不被实验条件变化所干扰。通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性。本 研 究 利 用 重 叠 PCR 技术，对 EGR1 启 动 子 原 序 列 上 的 ELK1 结合位点 （cccgccggaacaac）进行定点突变，并将突变后的 EGR1 启动子序列转入表达载体 pGL3-basic，通过双荧光素酶实验证明 ELK1 结合位点突变后基因启动子活性明显下降，表 明 ELK1 对 EGR1 的转录具有直接调控作用。与此同时，重组 pGL3-EGR1mt 为研究 EGR1 在 肿瘤发生发展分子机制和功能的研究奠定了基础。参考文献 (References）1 Yu J, Baron V, Mercola D et al. 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