乙酰一肟检测尿素.ppt

尿素的测定,简 介,尿素又称脲，是体内蛋白质分解代谢的含氮终产物，不与血浆蛋白结合，分子量仅为60，体内生成量受蛋白质摄入量，机体蛋白质分解代谢及肝脏（生成尿素的唯一器官）功能的影响。尿素是表明游泳池水受到人体污染程度的一项重要指标。,二乙酰一肟（diacetylmonoxime）法检测尿素（urea）含量,原理：尿素与二乙酰在酸性环境中加热可缩合成红色的二嗪衍生物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故通常用二乙酰一肟代替，它与强酸作用，产生二乙酰。后者再与尿素反应，缩合生成红色的二嗪衍生物。,临床二乙酰一肟法,H+二乙酰一肟+水 二乙酰+羟胺 H+二乙酰+尿素 二嗪化合物（粉红色）,泳池二乙酰一肟法,临床二乙酰一肟法测定尿素,1 原理 尿素与二乙酰一肟在酸性条件下，经镉离子（或三价铁离子）的催化产生缩合，并在氨基硫脲存在下，生成了4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。,2 试剂21 酸性试剂：在 1 L容量瓶中加入蒸馏水约 100 mL，然后加入浓硫酸 44 mL 及 85%磷酸 66 mL，冷却至室温后加入硫氨脲 80 mg，硫酸镉 2 g，溶解后用蒸馏水稀释至 1 000 mL，贮棕色瓶中放冰箱内保存半年不变。22 2%二乙酰一肟溶液：取 2 g 二乙酰肟，溶于蒸馏水中，定容 100 mL混合均匀，即可使用。尿素使用液：取酸性试剂 90 mL加 2%二乙酰一肟 10 mL，混合均匀即可。,3 方法31 定性测定：取使用液 2 mL 加入试管中，加 0.1 mL牛奶，在电炉上快速加热至煮沸，保持沸腾 1 min，观察颜色，用不含尿素样品做比较。正常奶颜色为淡红色，添加尿素的牛奶反应颜色为玫红色。32 定量测定：取5mL使用液加入0.1mL牛奶，于20 mL的螺口试管中，加盖拧紧，于 95 水浴中反应 20 min，过滤后，于 525 nm处测定吸光值。,4 结果 由于正常牛奶中含有少量的尿素，所以正常牛奶的反应试管也是有颜色的，由于尿素含量较少，所以颜色为淡红色。尿素含量异常的牛奶，反应后颜色为玫红色。两者的区别明显，在实际的质量控制中，应以正常奶做比较，来判断原料奶中尿素含量的水平，进而做出判断。,5 小结优点：灵敏度高，操作简单，适用于自动仪器分析。缺点：反应不专一，线性范围窄（150mmol/L),特异性低，试剂腐蚀性强，加热有异味释放。难以实现自动化。,游泳池水中二乙酰一肟的检测方法,常采用卫生部颁发的二乙酰一肟分光光度法(简称原法)。,二乙酰一肟分光光度法（国标法）,1.原理 尿素与二乙酰一肟及安替比林反应呈现黄色,在波长460 nm 处有最大吸收峰,与标准系列比较定量。,2 试剂21二乙酰一肟溶液(2 g/L):取02g二乙酰一肟CH3COC(NOH)CH3 溶于10%乙酸中,并稀释至100 ml,保存于棕色瓶中。22安替比林溶液(2 g/L):取02g安替比林C6H5NN(CH3)C(CH3)CHCO溶于1+1硫酸中并稀释至100 ml,保存于棕色瓶中。23尿素标准储备溶液(100g/ml)和尿素标准使用溶液(10g/ml)。24仪器和器材UV-2102C型分光光度计、沸水浴锅、25 ml棕色具塞比色管(粗细、玻璃厚薄均匀一致)。,3 分析步骤31 吸取水样10ml（尿素含量在00010015mg范围内）于25ml棕色具塞试管中，另取棕色具塞试管加入尿素标准使用液0、01、03、05、07、09、11、13、15ml，并用纯水稀释至25ml。（注：显色后溶液遇光退色，故需用标色法）。32 于上述各管加入10ml二乙酰肟溶液，混均。再加安替比林溶液20ml，混匀。33 将上述试管在沸水浴中加热50min。取出并在流动的自来水中冷却2min。立即以纯水为对照，在460nm处，用1cm比色皿，测定各管吸光值（加热4555min，呈最深色，若再延长时间吸光值下降）。34 以浓度对照吸光值，制备标准曲线。以水样吸光值从曲线上查出尿素含量。,4 小结,优点：操作简便、灵敏度高。缺点：线性范围窄、反应时间长、标准曲线相关系数难以达到0.1999以上，对于尿素浓度高的水样,虽可将水样稀释后进行测定,但稀释倍数难以估计,所以需反复重测,既费时,又浪费试剂。,二乙酰一肟分光光度法（改进）,1 原理 目前二乙酰一肟-安替比林分光光度计 1 是测定尿素的唯一标准方法,该法存在标准曲线线性范围较窄(011 11 5 m g/L),吸光度偏低,反应产物不稳定,溶液显色后遇光褪色等多种问题,对检测结果影响较大,为此本法参阅有关文献 2,3,通过摸索,将国标法中的标准曲线扩大,定容体积由25 m l改为10 ml,使线性范围变宽,吸光度的值增大,标准系列的稳定时间长,结果满意,其准确度、精密度较好,能满足基层实验室的需要。,2 试剂21 02二乙酰一肟溶液：称取02g二乙酰一肟CH3COC：（NOH）CH3溶于10乙酸中，并稀释至100ml，保存于棕色瓶备用。22 02安替比林溶液：称取02g安替经林（1，5二甲基2苯3吡唑酮C6H5NN（CH3）C（CH3）：CHC：O），溶于11硫酸中并用混酸稀释至100ml，棕色瓶中保存。（注：硫酸浓度大于11时，显色缓慢且操作不便。）23 尿素标准溶液：准确称取01000g尿素于小烧杯中，加少量纯水溶解后转入1000ml容量瓶中，加01ml氯仿并用纯水定容，此液每ml含01mg尿素。冷藏保存。24 尿素标准使用溶液，准确吸取尿素标准储备溶液1000ml于100ml容量瓶中，用纯水定容，此液每ml含001mg尿素。,3 分析步骤31取游泳池水样10 ml于25 ml比色管中。另取尿素标准使用溶液(10g/ml)0、025、050、100、200、300、400、500、600 ml(尿素含量为0、25、5、10、20、30、40、50、60g),各管加纯水至10 ml,做标准系列。32样品及标准系列管各加入110 ml二乙酰一肟溶液,摇匀,再加入210 ml安替比林溶液,混匀后置沸水浴锅中煮沸20 min(建议同时放入同时取出,或按次序放入、取出,以保证加热时间的一致。在样品多时这点尤为重要),在沸水浴时轻轻盖上比色管塞,以防溶液蒸发。33停止加热后在冷水浴(1015,冷水浴水位高于比色管中溶液为佳)中冷却2 min,再次混匀后以纯水为对照,在460 nm处,用1 cm 比色皿,在避免阳光直射的条件下测定吸光度。绘制标准曲线并求得样品中尿素的浓度。,4 小结 用改进后的二乙酰一肟比色定量法,标准曲线线性范围较原法有了很大提高,最高浓度可以测到610 mg/L,超过610 mg/L 的水样进行一倍稀释基本上均在标准曲线线性范围以内,并保持原法的精密度与回收率;煮沸时间由原来的50 min缩短至20 min,消除了由于长时间煮沸造成的各管溶液体积不一致、从而导致测定结果不准确的弊端;方法的精密度、准确度好,优于原法,且符合卫生检验的要求。,国标法改进前后对照表,二乙酰一肟-氨基硫脲（thiosemicarbazide）法,氨基硫脲,作用,酸性试剂中的氨基硫脲与硫酸镉可促进尿素与双乙酰结合，提高灵敏度和显色后的稳定性。,化学式,CH5N3S,结构式,H2N,N,H,C,II,S,NH2,起主要作用,2（NH2)2-C=O+2（NH2)2-C=S-（NH2)2-C=C(NH2)2+SO2+S（尿素）（氨基硫脲）,反应关系式,1原理 尿素在氨基硫脲存在下，与二乙酰一肟在强酸环境中加热，生成红色的二嗪衍生物。显色强度在一定范围内与尿素含量成正比。,2 试剂21 酸性试剂 浓硫酸200ml与磷酸300ml混匀，冷至室温。加 氨基硫脲50mg，硫酸镉2.0g溶解，棕色瓶冷藏至少可保存一年。22 二乙酰一肟溶液 称取4.0g二乙酰一肟，溶解后加纯水至200ml，棕色瓶冷藏可保存半年。23 尿素标准贮存液 准确称取0.1000g尿素，加少量纯水溶解 后，移至1000ml容量瓶中，加5滴三氯甲烷作防腐剂，用纯水定容至刻度。4保存，此溶液尿素浓度为0.1mg/ml。24 尿素标准使用液 临用时将尿素标准贮存液稀释10倍。此溶液尿素浓度10ug/ml。,3 操作步骤31取水样10ml于具塞标准比色管中。另取比色管8只，分别加入10ug/ml的尿素标准使用液0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00ml，各加水至约10ml。32 每管各加酸性试剂5.0ml，2%的二乙酰一肟溶液2.0ml，加纯水至25ml。沸水浴12分钟，取出后用冷水冷却至室温。33 以空白管调零，在540nm处，用1cm比色皿测定各管吸光值。以浓度对照吸光值，制备标准曲线。以水样的吸光值在标准曲线上查出尿素含量。,4 结果 本法操作简便，溶液显色稳定，线性范围宽，试剂稳定时间长，适合平时工作中使用。,作用,作显色稳定剂。,化学式,（CH3）2CHOH,结构式,H3C,异丙醇,CH,CH3,I,OH,二乙酰一肟-异丙醇-安替比林法,1 原理 在原发的基础上，选择异丙醇作显色稳定剂对游泳池水中尿素进行测定，使标准曲线的线性范围有了很大的提高，缩短了煮沸时间，方法的精密度、准确度优于原法，且符合卫生检验要求。,2 试剂 2.1 二乙酰一肟-异丙醇溶液 称取1.0g二乙酰一肟溶于1+9乙酸溶液中，并使其总量为100ml，于此溶液中加入异丙醇50ml，混匀，棕色瓶中保存。2.2 安替比林溶液 称取0.2g安替比林溶于1+1硫酸中，并使其总量为100ml，棕色瓶中保存。2.3 尿素标准贮备液 称取0.1000g尿素，溶于少量水后移入1000ml容量瓶中，加0.1ml氯仿并用水定容，冷藏保存，此液1.00ml含0.100mg尿素。2.4 尿素标准使用液 吸取尿素标准贮备液10.00ml于100ml容量瓶中，以水定容，此液1.00ml含10.0ug尿素。2.5 实验用水均为去离子水。,3 测定步骤3.1 吸取水样10.0ml于25ml无色具塞比色管中，另取同型比色管分别加入尿素标准使用液0、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml，以水定容至25ml。3.2 于上述各管中加入二乙酰一肟-异丙醇溶液1.50ml，混匀。再加入安替比林溶液2.00ml，混匀。3.3 各管加塞后同时置沸水浴中加热20min，取出，在流动的自来水中冷却2min。以水为对照，于460nm处，用1cm比色皿测定各管吸光度。3.4 计算标准系列直线回归方程，以水样吸光度代入方程，求出水样尿素含量。,4 小结 与标准方法比较，有遇光不退色，可用普通无色比色管操作；线性范围扩大，一般游泳池水样可不经稀释一次完成测定；沸水浴时间大大缩短，节约时间等优点。应用于游泳池水中尿素的测定，其重现性、回收率、与标准方法的对照试验，均获得满意结果。,临床与预防二乙酰一肟法的区别,3 讨论3.1 尝试以异丙醇、异丁醇、正戊醇、丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甲醛、正辛醇、异戊醇等十余种有机溶剂作显色稳定剂试验，结果显示：甲醛使显色无法进行；正辛醇、异戊醇水溶性差，溶液出现混浊；其余试剂均有显色稳定作用，但以异丙醇显色后最稳定，灵敏度较高，水溶性好，且为常用试剂，无毒，易购得，故选之。异丙醇的使用，弥补了标准方法3.2 经实验，异丙醇用量在0.40.6ml/管时，空白值较低，灵敏度较高，稳定性好，故选其中间值（0.5ml/管），按此比例将其与二乙酰一肟试剂混合后加入，操作方便，且不影响二乙酰一肟试剂的稳定性。3.3 当二乙酰一肟溶液用量为1ml/管，其浓度为10g/L与20g/L时，灵敏度较高，且两者基本相同，而当其浓度为2g/L时，灵敏度大大降低，故选其浓度为10g/L。因其与异丙醇混合后一次加入，为达二物质最佳显色量，故该混合试剂加入量为1.5ml。,3.4 当安替比林溶液用量为2ml/管，浓度为2g/L与10g/L时，对测定基本无影响，故保持标准方法中该试剂2g/L的浓度。3.5 实验表明，沸水浴时间从1540min，随加热时间的延长，吸光度增加，标准斜率加大，继续延长加热时间，则线性变差。加热25min时，50ug管吸光度近0.8，仪器测定误差加大，故本法选用沸水浴加热20min，比标准方法的沸水浴50min时间大大缩短。因沸水浴时间不同，吸光度差别较大，故水样应与标准系列同批测定。同时，沸水浴容量应较大，避免过挤致受热不匀，使反应不均匀、完全。3.6 作标准系列及水样显色定容后立即至26h稳定性试验，实验结果显示：在显色定容后2h内呈色稳定，测定偏差小，比色测定最好在此期间完成。延长至20h间，吸光度值逐渐增大，但在此期间只要标准系列与水样为同批测定，对低、中浓度样品结果基本无影响，高浓度样品偏差稍大，但尚可接受（相对偏差5%）。若再延长时间则不可取。3.7 游泳场所卫生标准（GB9667-1996）中规定尿素应3.5mg/L。本法线性范围包容了上述浓度，对一般水样可直接一次测定完成，避免了标准方法测定尿素浓度在1.55mg/L水样时，因超出线性范围需将样品稀释后重新测定的麻烦及引入的误差。,本法从十余种有机溶剂中筛选出异丙醇作显色稳定剂，并经反复实验研究，对游泳池水中尿素测定的标准方法作了改进。与标准方法比较，有遇光不退色，可用普通无色比色管操作；线性范围扩大，一般游泳池水样可不经稀释一次完成测定；沸水浴时间大大缩短，节约时间等优点。应用于游泳池水中尿素的测定，其重现性、回收率、与标准方法的对照试验，均获得满意结果。,自己的想法,化学性质：红色粉末，微溶于水，溶于醇和稀酸。主要用于鉴定羰基化合物（-CO）。是易燃易爆品，需小心使用。显色作用：在酸性介质中，羰基化合物与2，4-二硝基苯肼（的甲醇-盐酸溶液）反应，生成 2，4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈暗红色，可用于分光光度法（445nm处测吸光度）或目视比色法测定羰基化合物。,关于2,4-二硝基苯肼做显色剂替代安替比林的说明,反应方程式：C6H3(NO2)2NHNH2+CO(NH2)2 C6H3(NO2)2NHN=C(NH2)2+H2O,