峰高法和峰面积法的选择.docx

峰高法和峰面积法的选择在色谱定量分析中，选用峰高法还是选用峰面积法，主要决定在检测器的线性范围内，峰高 和峰面积测量的准确性和重复性。除了归一化法最好用峰面积法外，其他三种定量方法中峰 高和峰面积都可用作精确的定量方法。在检测器的线性范围内，峰高和峰面积测量的准确性受色谱分离度的影响，要准确地测 量峰高和峰面积，色谱分离应达到一定的分离度才行。图2-3-18至图2-3-22给出了峰高 比1:1至16:1时的标准分离度曲线，每张图上的黑点表示了每个峰峰尖的真实位置，此黑 点与图中所示的峰尖的垂直位移就是测量误差。峰高比越大，要求能准确测量峰高的分离度 也越大。峰高比为1/1和2/1时，峰高能得到准确测量的最低分离度为0.8；峰高比为4/1时， 峰高能得到准确测量的最低分离度为1.0；峰高比16/1时，峰高能得到准确测量的最低分 离度为1.25。关于分离度对峰高测定准确度的影响大致可认为：当分离度Rs-1.0时，相对 峰高从128:1变化到1:128时，峰高的测量误差小于+-3%。图2-3-18标准分高度曲线（峰高比1/1，分离度0.4 - 1.25>图2-3-19标准分离度曲线（峰高比2/1，分高度0.4 - 1.25）峰高比=2/10.50,0.71.25分离度对峰面积测量的影响较峰高要大，即2-3-23给出了分离度Rs=1.0和不同峰高 比时，面积较小峰的峰面积测量值为其真实面积的百分数。由图可见，当峰高比大时，面积 较小峰的峰面积测量准确度降低，此时测量较大峰的峰面积较准确，误差不超过1%。小峰 峰面积测量误差都是负值，而大峰峰面积测量误差都是正值。如果两个重叠峰峰高比为x（x>1），则两个峰峰面积测量误差关系为：图2-3-22标准分离度曲线峰高比16/1，分离度Q .4- 1.25)1,25峰高比16 J |在图2-3-22中，当峰高比为"1时.按小峰的峰而枳!量误差为此时较大帷的 峰面积删量误差则为=而当峰高比为16/1时较小峰的峰面税蒯量误基I为- 1疏，此时较大嶂的峰面税测童误差则为二0用如 由此可见，当分高度 不好时，洲呈为峥的峰而枳的误差比泄量小畔的峰萨:的误菱要大此时测其大睡的蜂而阳误 差桁小些怛仍比测量大峰的峰高的误差要大些。前面己指出者分鹿度的二|,D当蜂高比从 1*：1至1：1邱时，峰高的典量误差最大为±3Wt而当分离度 凡=【山,若要求蜂而枳的删量 误差在±4略之内时，怙计峰高比只能从3:1至I：慕 所以，峰面积定量方法比峰高定量方法要 未有更好的分离度*在分祺度不好的情吒下，用峰而积定量时，可以从峰谷高盘J与小峰峰高 3“之比来估律很!1量小峰蜂面枳的相利谟差2-3-34）.2-3-12列出了不同如*时,溯虽小峰峰而积的相对误空.表 2-3-12 不同 h1/h2 时测量小峰峰面积的相对误差(峰高剥峰薜祝的推确测量还受到色谱分离参敝容量因子皿）柱理论塔版数：rr）和 流对相芒速"的影响-L H .河*等人.根据沌度型检测器（钮U：的TE上：l E II侦的IS RI，荧光检测器等）的特点，建立了 -些规则来预测备棘色谱分离参数改变肘检测器的响曲 值*继而对定盅分析时测命峰高和峰而积的准殖度的影响见表2-3-B）.表2-3-13色谱分离参数对浓度型检测器峰高和峰面积定量分析精度的影响 （由表2-3-13数据可看出：当流动相（GC的载气，HPLC的洗脱液）流速可以准确控制， 而影响容量因子（k'）的一些因素（如GC的柱温、HPLC的流动相的组成）不能保持恒定（如 使用GC的程序升温，HPLC的梯度洗脱）时，用峰面积定量较好；而当容量因子（k'）和柱 效（n）保持不变，流动相流速不稳定，有微小变化时，峰高受到的影响要小于峰面积，此 时用峰高定量能得到较为精确的定量结果。当柱效（n）有所变化时，使用峰面积定量可得 到较精确的结果。总之，在分离度较好，色谱峰形较好，峰面积可以准确测量时，以用峰面积法定量为好。 特别是在气相色谱使用程序升温和液相色谱使用多元梯度洗脱时，最好使用峰面积法定量。 但当分离度不好，色谱峰形不好（如严重拖尾）时，峰面积测量引起的误差较大，此时使用 峰高法定量较好。保留时间短的色谱峰峰形较尖（峰尾宽较小），此时峰高测定较峰面积测 定准确，宜用峰高法定量；而保留时间长的色谱峰峰形较宽（峰尾宽较大），此时峰面积测 定较峰高测定准确，宜用峰面积法定量。把所有出峰的组分含量之和按100%计的定量方法，称为归一化法。当样品中所有组分均能 流出色谱柱，并在检测器上都能产生信号的样品，可用归一化法定量，其中组分i的质量分 数可按式（2-3-18）计算：k , - x（ 2 - 3 - 1 ）式中.1,组分j的峰面枳：'.广,i组分的.质最校正网予。当_r,为净尔校iE因子或体和校正因子肘.所得结果分制为e组分的摩不百分含最谚# 积百分数。一化法的优点是简便、准确，特别是进样量不容易准确控制时，进样量的变化对定量结 果的影响很小。其他操作条件，如流速、柱温等变化对定量结果的影响也很小。归一化法定量的主要问题是校正因子的测定较为麻烦，虽然一些校正因子可以从文献中 查到或经过一些计算方法算出（本章第一节有介绍），但要得到准确的校正因子，还是需要 用每一组分的基准物质直接测定。归一化法主要用于GC的定量测定。！的一些主要检测器（如FID和TCD）对某些组分 （如同系物）的校正因子相近或有一定的规律，从文献中可以查到或进行计算。当校正因子 相近时，可直接用峰面积归一化进行定量。例如，表2-3-14给出了 C8芳烃异构体的GC分 析结果。四个组分的FID检测器的质量校正因子在0.96-1.00之间，结果给出了用校正因 子进行归一化法的定量结果和直接用峰面积进行归一化的定量结果。比较两个结果，误差很 小，在这种情况下直接用峰面积归一是十分方便的，也是误差范围所允许的。表 2-3-14 C8 芳烃异构体的分析 (FID 检测器)(对于HPLC，由于经常使用的一些检测器（如UV,荧光等），不仅对不同组分的响应值 差别较大，不能忽略校正因子的影响，而且对于某些组分可能没有响应值（即不出峰），因 此在HPLC中很少使用归一化法定量。标准曲线法也称为外标法或直接比较法，这是在色谱定量分析中，特别是HPLC定量分析中 比较常用的方法，是一种简便、快速的绝对定量方法（归一化法则是相对定量方法）。与分光光度分析中的标准曲线法相似，首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。 具体作法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等 体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线， 此标准工作曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统 误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。在测定样品中的组分含量时，要用与绘制标准工作曲线完全相同的色谱条件作出色谱 图，测量色谱峰的峰面积或峰高，然后根据峰面积和峰高在标准工作曲线上直接查出进入色 谱柱中样品组分的浓度，也可通过式（2-3-19）计算这一浓度。IpJ 网=牌心.）（2-3- 19）式中 .1,（ ）i坦分峰的峰而枳（蜂高）；/i坦分标准工作曲线的斜率=知道进入色谱柱中样品组分的浓度后，就可根据样品处理条件及进样量来计算原样品中 该组分的含量了。当欲测组分含量变化不大，并已知这一组分的大概含量时，也可以不必绘制标准工作曲 线，而用单点校正法，即直接比较法定量。先配制一个和待测组分含量相近的已知浓度的标 准溶液，在相同的色谱条件下，分别将待测样品溶液和标准样品溶液等体积进样，作出色谱 图，测量待测组分和标准样品的峰面积或峰高，然后由式（2-3-20）直接计算样品溶液中待 测组分的含量：式中叫标准样品涪液质量分%：叫一样品溶液中待测组分质量分数，奴松尚样品的峰而枳峰高L1,（样品中i组分的峰而枳（峰高L单点校正法实际上是利用原点作为标准工作曲线上的另一个点。因此，当方法存在系统 误差时（即标准工作曲线不通过原点），单点校正法的误差较大。标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就很简单了，计算时可直接从标 准工作曲线上读出含量，这对大量样品分析十分合适。特别是标准工作曲线绘制后可以使用 一段时间，在此段时间内可经常用一个标准样品对标准工作曲线进行单点校正，以确定该标 准工作曲线是否还可使用。标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温度，流动相 流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。另外，标准工作曲 线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），因此对样品前处理过 程中欲测组分的变化无法进行补偿。选择适宜的物质作为欲测组分的参比物，定量加到样品中去，依据欲测组分和参比物在检测 器上的响应值（峰面积或峰高）之比和参比物加入的量进行定量分析的方法称为内标法。它 克服了标准曲线法中，每次样品分析时色谱条件很难完全相同而引起的定量误差。把参比物 加到样品中去，使欲测组分和参比物在同一色谱条件下进行分析，可使定量的准确度提高， 特别是内标法测定的欲测组分和参比物质在同一检测条件下响应值之比与进样量多少无关， 这样就可以消除标准曲线定量法中由于进样量不准确产生的误差。内标法的关键是选择合适的内标物。内标物应是原样品中不存在的纯物质，该物质的性 质应尽可能与欲测组分相近，不与被测样品起化学反应，同时要能完全溶于被测样品中。内 标物的峰应尽可能接近欲测组分的峰，或位于几个欲测组分的峰中间，但必须与样品中的所 有峰不页至即完全方升，冉序物的加人屋篇欲割组分相近-叫款浏的鼠为内 标物小的量为，.廿卿组分和内标物）的峰面积（或峰高）分别为也或血）和旗（或 4b待测沮分心和内标物的质站匏时校正因于分别为匕和匕，期忙两式相除得：式中为待测组分“）对的标物的植最相对校正因子.可由实验测定或由文献值进S 订算得到.为使内标法适用于大量样品分析可时内标法作一改进将内标活与标准曲线法相结合, 即使用的标标准曲戏法。方法如卜用H测组分的纯物质配成一系列不同浓度的标准溶液。 蜓相同怵枳的不同裱度的该标庶溶液，分别加入同样量的内标物，然后在相同的色谱条件下分 别加入内标的系列标准溶液.以欲测组姓与内标物的响应值之比君翌沏械坐际，标推溶 液液度为横坐标作图，得到一条内标杯准工作曲线，此直线陶通过原点如不蜥过爆点.刈说明 方法有系统误差L分析样品时、取和绘制内标标准工作曲埃时相同体枳的桦晶和相同量的内 标物.在和舱制内标标准工猝曲统相同的色谱条件卜测出欲测样品和内标物的响应值之比 井斛,由此比值河在内株标准工作曲线上查出样品中簌测组分的浓度十进而切以算出欲测 扭分在样品中的言量d这一方法可以省去测定相对授正困子的工作，特别适用于大批量样品 的分析删定工作.内标法的优点是：进样量的变化，色谱条件的微小变化对内标法定量结果的影响不大， 特别是在样品前处理（如浓缩、萃取，衍生化等）前加入内标物，然后再进行前处理时，可 部分补偿欲测组分在样品前处理时的损失。若要获得很高精度的结果时，可以加入数种内标 物，以提高定量分析的精度。内标法的缺点是：选择合适的内标物比较困难，内标物的称量要准确，操作较麻烦。使 用内标法定量时要测量欲测组分和内标物的两个峰的峰面积（或峰高），根据误差叠加原理， 内标法定量的误差中，由于峰面积测量引起的误差是标准曲线法定量的J2倍。但是由于进 样量的变化和色谱条件变化引起的误差，内标法比标准曲线法要小很多，所以总的来说，内 标法定量比标准曲线法定量的准确度和精密度都要好。标准加入法实质上是一种特殊的内标法，是在选择不到合适的内标物时，以欲测组分的纯物 质为内标物，加入到待测样品中，然后在相同的色谱条件下，测定加入欲测组分纯物质前后 欲测组分的峰面积（或峰高），从而计算欲测组分在样品中的含量的方法。标谜加入法具体作法如下：首先在一定的色漕条件下作出欲分析样品的色谱图，测定其中 敌剖坦会口的岬面枳M或衅高/< J,罪.后在该杆品中代砒如入己接谊为蛆的欲测明分 捉，在与上一述色谐条件完全相同的色谐条件卜.作出已加入款丽组分（"柘的样品的也港捌、 测定这时欲测沮分以的峰面粮A/<.成峰高H工此时根据式3-1间得：电=>2322）叫 +-lit - f：A W（2-3-2式中 虬一-欲测组分1在样品中的含义/和7/加入欲涮蛆分i前后两次蒯定时的能对校正因子-因为tin A秋割组?r惟后两次、定的色.曹条件定全相同. 如a的也该与欲测组又是同-物腹,所以有/； =* 将式（"3-WQ和式3-3-23）两式相除得TV?, + 上£ A '（ &）Wj -"也）由式口-3-24）经过遭算町饵：（2-3-25）上.1,5 J由式口-3-旃）经过运算可梅:' 2-3-25）由“式口 U4用所加人他欲测用加"的平.玉-.以及加入欲制帽分前后阿次煎定的怦I面g 用.1 t戒峰高岛和虹），就阿tw算高样品中欲剌组gq的含鼠标准加入法中加人的欲测坦分。）还可以作为另一欲瓣组分"）的内标物再用前述的内 标法定星的方法来蒯定欲刻组汁门的含昂_ 此般福耍褪定欲删组分J）a另一敬刺匏分“）的 相对校正因子.用式（2-3-2i）H算欲测给分的含留，虬:=f ':?）W：i + W式中 厂-粗分j时组分i的帽对校正因于：.4/A）组分j的好而秋峭高，标准加入法的优点是：不需要另外的标准物质作内标物，只需欲测组分的纯物质，进样 量不必十分准确，操作简单。若在样品的前处理之前就加入已知准确量的欲测组分，则可以 完全补偿欲测组分在前处理过程中的损失，是色谱分析中较常用的定量分析方法。标准加入法的缺点是：要求加入欲测组分前后两次色谱测定的色谱条件完全相同，以保 证两次测定时的校正因子完全相等，否则将引起分析测定的误差。