中药有效成分提取分离和结构鉴定.ppt

第二节 中药有效成分的提取、分离方法,基本要求掌握:溶剂提取法的原理；浸渍法、煎煮法、回流提取法和连续回流提取法的适用范围及特点；渗漉法的特点；两相溶剂萃取法的原理和方法；结晶纯度的判定；色谱法在中药化学成分分离中的应用。熟悉：其它内容。,提取分离中药有效成分有两种情况：第一，从中药中提取已知的有效成分，或已知的化学结构类型者。第二，对中药有效成分的性质一无所知。,对中药所含成分进行提取时：使杂质不被提取出来或在处理过程中尽可能地除去杂质最后获得有效成分,注意事项！1、基原鉴定 2、查阅文献，了解前人的经验。3、对未知成分，综合考虑以上因素。4、化合物的结构与极性（1）极性基团与非极性基团的性质与数量。（2）分子体积大小。,（3）酸性基团加碱成盐为极性物质；碱性基团加酸成盐为极性物质；分子易于形成分子内氢键极性变小。极性基团：-COOH、OH、-NH2等 中等极性基团：-O-R、-COOR等 非极性基团：烷基等,室温、加热，冷提杂质较少，冷时难溶，而热提效率较高，热时易溶；一般采用温和的条件，不用酸碱；水、有机溶剂（缺点）；有效成分伴有杂质时，溶解度显著增加；工厂生产方法和实验室方法。,溶剂提取法水蒸气蒸馏法超临界流体萃取法升华法超声波提取法微波辅助提取法酶法、半仿生提取法破碎提取法压榨法,中药化学成分提取方法分类,1、溶剂提取法 选用适当的溶剂将中药中的被测成分溶出的方法。（1）原理 根据中药中有效成分在溶剂中的溶解性质，选用对有效成分溶解度大，对其他成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。,一、提取方法,（2）溶剂选择 遵循“相似相溶”原则。即中药成分的亲水性或亲 脂性应与溶剂的此项性质相当。选择溶剂要注意以下三点：溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；溶剂不能与中药的成分起化学变化；溶剂要经济、易得、使用安全等。,常用提取溶剂按极性由弱到强的顺序,石油醚四氯化碳苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯正丁醇 丙酮乙醇甲醇水,Simple percolate assembly,1、溶剂提取法（3）具体方法1)冷提：适用于受热不稳定的成分。浸渍(Maceration)渗漉（Percolation）,一、提取方法,工业生产用的渗漉装置,一、提取方法,2)热提：煎煮法（Decoction）回流（Refluxing）连续回流（Continuous Refluxing）,Simple refluxing assembly,Assembly of Soxhlet extractor,一、提取方法,水 糖类、有机酸、酚类、鞣质、无机盐、氨基酸、蛋白质、果胶、苷类、水溶性生物碱甲醇、乙醇、丙酮 黄酮、蒽醌、有机酸、酚类、香豆素、苷类、生物碱及其盐正丁醇 皂苷,乙酸乙酯：黄酮苷氯仿：乙醇2：1 强心苷 乙醚、氯仿 生物碱、苷元、醌石油醚、己烷 蜡、树脂和叶绿素、挥发油、萜类、甾体、脂肪油、脂溶性色素、苷元,2.水蒸气蒸馏法（water-steam distillation）提取具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的成分，如挥发油。,Simple water-steam distillation refluxing assembly,一、提取方法,3.升华法（sublimation）用于具有升华性的成分提取，如香豆素，蒽醌，樟脑等。,一、提取方法,超临界流体的密度与液体很接近，而它又具有气体扩散性能常用的临界流体有CO2、N2O、乙烷、丙烷等。,4.超临界流体提取法（supercritical fluid extraction SFE)利用溶剂在超临界条件下特殊的流体性能对样品进行提取，为20世纪80年代迅速发展起来的一种提取方法。,一、提取方法,控温面板,高压泵,超临界CO2萃取实验装置示意图,原料,超临界萃取实验装置与实验方法,小试实验装置图,实验装置小试实验装置,上世纪50年代初进入试验阶段，如从石油中脱沥青70、80年代，SFE越来越多的用于食品、香料的提取90年代，开始从植物药中提取成分，如蛇床子、茵陈蒿、桑白皮中提取成分。,中小型SFE装置图,为物理过程，无化学反应，生物活性不减。大能量的超声波产生的极大压力造成植物物细胞壁及整个生物体破裂，胞内物质的释放、扩散及溶解。,5.超声提取法（ultrasonic extraction),实验室用小型超声仪,一、提取方法,工业生产用超声仪,6.微波提取法（microwave extraction）,具有穿透力强、选择性高、加热效率高等显著特点，而且其操作简便、快速、节能、高效。缺点：工业化设备少、成分变化、生物活性变化。,工业生产用微波提取罐,一、提取方法,二、分离与精制方法,1、根据物质的分配比2、根据物质的溶解度3、根据物质的吸附性4、根据物质的解离程度5、根据物质的分子大小,二、分离与精制方法,根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离（1）两相溶剂萃取法：利用混合物中各组成成分在两相溶剂（互相饱和的水相与有机相）中分配系数不同而达到分离的方法。,分配系数K=C1/C2C1、C2为被分离物质在上相和下相中浓度,影响分离的因素分离因子，分配系数K=KA/KB pH值 对于酸性、碱性、两性化合物，pH值可改变它们的存在状态。,二、分离与精制方法,药材,甲醇或乙醇提取，回收醇,两相溶剂萃取在操作中的注意要点：,先用小试管猛烈振摇约1min，观察萃取后二液层分层现象。如果容易产生乳化，大量萃取时要避免猛烈振摇，可延长萃取时间。,乳化现象解决办法将乳化层分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤；或将乳化层稍稍加热；或将乳化层稍稍加盐；或较长时间放置并不时旋转，令其自然分层；或离心。,水提取液的浓度最好在比重1.11.2之间，过稀则溶剂用量太大，影响操作。溶剂与水溶液应保持一定量的比例。一般萃取34次即可。如为小量萃取，可在分液漏斗中进行；如系中量萃取，可在下口瓶中进行。,（2）酸碱性成分的分离pH-梯度萃取法 按酸碱性强弱不同分离酸性、碱性、中性物质，改变pH值使酸碱成分呈不同状态。酸水：0.1%-1%H2SO4、HCl、HOAc。碱水：0.30.5NaOH,酸性化合物可分为强酸性、弱酸性和酚性三种，它们分别溶于碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠，借此可达到分离。内酯类化合物不溶于水，但遇碱开环生成羧酸盐溶于水，再加酸酸化，又重新形成内酯环从溶液中析出，从而与其它杂质分离。,（3）液-液分配柱色谱法 色谱法或色谱学，又称为色层法或层析法，是一种物理化学分离和分析方法。色谱法是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差（分配层析），吸附剂对组分吸附能力不同（吸附层析），离子交换，分子的大小（排阻层析）的微小差异而分离。,色谱法分类按两相物理状态分类 流动相为气体称气相色谱，流动相为液体称液相色谱。固定相可以是液体或固体，可组合成四种色谱类型：气固色谱 GSC（gas-solid chromatography)气液色谱 GLC(gas-liquid chromatography)液固色谱 LSC(liquid-solid chromatography)液液色谱 LLC（Liquid-liquid chromatography),按固定相的形态分类,.柱色谱(column chromatograaphy)固定相装在色谱柱内称为柱色谱。.平板色谱(planar chromatograaphy)固定相呈平板状，包括薄层色谱和纸色谱。A 薄层色谱(TLC)固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板或塑料板上，或将固定相直接制成薄板状 B 纸色谱(PC)用滤纸作固定相或固定相载体的色谱,按分离过程物理化学原理分类,吸附色谱(adsoption chromatograaphy)用固体吸附剂(硅胶、中性氧化铝、活性炭、聚酰胺)作色谱固定相，样品各组分在吸附剂上吸附力的大小不同，因而吸附平衡常数不同，据此可将各组分分离。硅 胶：皂苷、蒽醌苷、强心苷、生物碱 氧化铝：生物碱、甾、萜 活性炭：氨基酸、糖、苷 聚酰胺：黄酮、蒽醌、鞣质,分配色谱(partition chromatograaphy)用液体作固定相，利用试样组分(亦称为溶质)在固定相中溶解、吸收或吸着(sorption)能力不同，因而在两相间分配系数不同将组分分离。在液液分配色谱中，根据流动相和固定相相对极性不同，又分为:A 正相分配色谱 B 反相分配色谱,正相分配色谱,简称正相色谱(NPC):以强极性、亲水性物质或溶液为固定相（氰基与氨基CN-NH2），非极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相，为正相分配色谱。分离：极性、中等极性分子,反相分配色谱，简称反相色谱（RPC）：若以弱极性、亲脂性物质为固定相（十八烷基硅烷ODS），极性、亲水性溶剂或水溶液为流动相(甲醇-水，乙腈-水），则称为反相分配色谱分离：非极性、中等极性分子,（3）液-液分配柱色谱正相色谱：固定相极性大，如水、缓冲液等；流动相极性小，如氯仿、乙酸乙酯等。载体：硅胶（含水可达17%），硅藻土，纤维素等。分离极性大或水溶性成分，如苷类、糖、生物碱等。洗脱顺序：极性小的物质先被洗脱出来。,反相色谱：固定相极性小于流动相。如HPLC反相柱，反相板。固定相：硅胶硅醇基结合烷基，如RP-2，RP-8，RP-18。亲脂性：RP-18 RP-8 RP-2。流动相(洗脱剂)：MeOH-H2O，CH3CN-H2O 洗脱顺序：分离极性小的成分，极性大者先洗脱下来。,（4）逆流连续萃取法（5）逆流分配法（CCD）（6）液滴逆流分配法（DCCC）（7）高速逆流色谱（HSCCC）,二、分离与精制方法,2.根据溶解度差别进行分离2.1 沉淀法 定义：中药提取物的溶液加入某些试剂后可降低某些成分在溶液中的溶解度而自溶液中析出，或有些中药化学成分能与某些试剂生成沉淀的一种方法。分类：试剂沉淀法、铅盐沉淀法、盐析法,二、分离与精制方法,（1）试剂沉淀法 分级沉淀法（水提醇沉法）碱提酸沉法：酸性成分,酸提碱沉法：生物碱的分离专属试剂沉淀法 某些试剂能选择性地沉淀某类成分。雷氏铵盐-生物碱；胆甾醇-甾体皂苷；明胶或蛋白质-鞣质。,（2）铅盐沉淀法 原理：利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐或络盐，而用于分离中药成分。如中性醋酸铅用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白质、粘液质、鞣质、树脂、酸性皂苷、部分黄酮等。,（3）盐析法 在混合物水溶液中加入易溶于水的无机盐（氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等），至一定浓度或饱和状态，使某些中药成分在水中溶解度降低而析出，或用有机溶剂萃取出来。,二、分离与精制方法,2.2 结晶法（纯化时常用）化合物由非晶形经过结晶操作形成有晶形的过程称为结晶。初析出的结晶往往不纯，进行再次结晶的过程称为重结晶。结晶经重结晶后所得各部分母液，再经处理又可分别得到第二批、第三批结晶，称为分步结晶法或分级结晶。,结晶的目的,一个固体成分达到了一定的纯度，在一定的条件下，就会呈结晶状，这样就可使结晶和母液分开，以达到进一步分离纯化的目的。,结晶的条件,1、有效成分在欲结晶的混合物中的含量 2、合适的溶剂条件3、有效成分在所选择的溶剂中的浓度 4、合适的温度和时间,3.1 吸附分类：物理吸附：无选择性的吸附，吸附解析发生迅速。吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭等；化学吸附：不可逆性。如碱性氧化铝对酚酸性成分的吸附等。半化学吸附：聚酰胺对酚酸类、醌类的氢键吸附。,分离与精制方法,3.根据物质的吸附性差别进行分离吸附色谱法,吸附原理：相似相吸影响吸附过程的三要素：吸附剂（固定相）；溶质（被分离物质）；溶剂（洗脱剂，展开剂，流动相）,二、分离与精制方法,3.2 硅胶、氧化铝：极性吸附剂：载样量大，吸附力强 硅胶：应用最广，适用于各类成分分离 氧化铝：有中性、酸性、碱性氧化铝。碱性氧化铝不适合于分离酸性成分，多用于分离生物碱。,二、分离与精制方法,3.2 硅胶、氧化铝：被分离物质吸附力与结构的关系 被分离物质极性大，吸附力强，Rf值小，洗脱难，后被洗脱下来。比移值（Rf）原点中心至斑点中心的距离/原点中心至溶剂前沿的距离,二、分离与精制方法,3.2 硅胶、氧化铝：官能团极性大小排列顺序：-COOH Ar-OH R-OH R-NH2，RNHR,RNR R R-CO-NRR RCHO RCOR RCOOR ROR RH溶剂(洗脱剂)的极性与洗脱力的关系洗脱剂极性越大,洗脱力越强。,二、分离与精制方法,练习:从黄花夹竹桃果仁中分离到七种强心苷成分,比较极性大小和硅胶柱上洗脱顺序。,单乙酰黄夹次苷B R”=COCH3,其它R”=H,二、分离与精制方法,二、分离与精制方法,答案：,1.极性大 小：黄夹苷A黄夹苷B 次苷D次苷C次苷A次苷B 单乙酰次苷B2.硅胶柱上的出柱顺序：后 先,3.3 活性炭非极性吸附剂吸附力与结构的关系 分子量大者 分子量小者 芳香族 脂肪族洗脱力与溶剂的关系 吡啶 醇 含水醇H2O应用:黄酮、生物碱的富集，糖的分离、脱色等。,二、分离与精制方法,3.4 聚酰胺(Polyamide):是由己酰胺聚合成的一类高分子化合物。,二、分离与精制方法,分离原理：主要通过酰胺键与酚羟基、酸、醌等形成氢键，产生吸附作用。吸附力取决于形成氢键缔合的能力。,3.4 聚酰胺 吸附力与结构的关系 a.形成氢键的基团数目越多,吸附力越强;b.形成分子内氢键者,吸附力减少;,二、分离与精制方法,d.芳香苷苷元苷,单糖苷双糖苷叁糖苷,c.芳香化程度越高或共轭键越多,吸附力越强;,二、分离与精制方法,3.4 聚酰胺 吸附力与结构的关系,溶剂的洗脱能力 水含水醇醇丙酮NaOH/H2O尿素/H2O,3.4 聚酰胺 常用溶剂：H2O，EtOH/H2O，EtOH 应用:分离黄酮类；除鞣质。,二、分离与精制方法,3.5 大孔吸附树脂(macro-reticular resin)分离原理:吸附(范德华力和氢键)和分子筛作用(多 孔性结构)树脂类型:非极性、中等极性和极性三种。非极性：由苯乙烯和二乙烯苯缩合而成，故又称 芳香吸附树脂。中等极性：含脂基的吸附树脂。极 性：含酰氨基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫不同极性功能的吸附树脂。,二、分离与精制方法,3.5 大孔吸附树脂 洗脱剂:H2O 及不同比例的含水醇。洗脱分离:H2O 洗:糖，水溶性色素 30%EtOH:极性大的成分 50-75%EtOH:皂苷类 95%EtOH:极性小成分 应用:除多糖，水溶性色素，富集苷类成分,二、分离与精制方法,4.根据物质解离程度不同进行分离离子交换法 固定相：离子交换树脂（聚苯乙烯高分子化合物，引 入交换基团）分类：阳离子交换树脂：强酸型 RSO3-H+弱酸型 RCOO-H+阴离子交换树脂：强碱型 RN+(CH3)3Cl-弱碱型 RNH2,RNHR,RNRR”,二、分离与精制方法,4.1 交换原理:阴离子交换树脂：,阳离子交换树脂：,4.2 应用：主要用于生物碱和有机酸的分离。,二、分离与精制方法,4.根据物质解离程度不同进行分离离子交换色谱法,透析法:半透膜,分子筛滤过作用。超速离心法:溶质在超速离心作用下具有不同的 沉降性或浮游性。凝胶滤过法:分子筛的作用(排阻色谱),被分离物 质按分子由大到小的顺序流出色谱柱。,5.根据物质分子大小差别进行分离凝胶滤过法,二、分离与精制方法,5.1 主要的几种方法,5.2 凝胶种类葡聚糖凝胶(Sephadex G):只适于在水中应用,分离多糖、蛋白质等.羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-10或LH-20)：适用于各类化合物的分离，除具有分子筛的特性外，还起到反相分配色谱的效果。常用溶剂有甲醇、氯仿-甲醇等。,二、分离与精制方法,5.根据物质分子大小差别进行分离凝胶滤过法,第一节 中药化学成分及生物合成简介第二节 中药有效成分的提取、分离方法第三节 中药有效成分化学结构研究方法,一、化合物纯度的鉴定（Identification of Purity）1.测熔点:看熔程 2.外观结晶色泽:均一性 3.色谱法:TLC 三种组成不同的溶剂系统,单一斑点;HPLC 单一峰；GC 单一峰；4.核磁法：不主张。,第三节 结构研究方法,二、已知化合物鉴定（Known compounds)1.有标准品(或对照品):Co-TLC(共薄层，三种系统)测混合熔点(相同溶剂结晶);测IR(考察是否重叠）2.无标准品:与文献值对照(相同的溶剂条件下：mp,IR,UV,1H-NMR,13C-NMR等)。,第三节 结构研究方法,三、未知化合物 多种谱学结合的结构解析 1.紫外光谱(Ultraviolet spectra，UV)为结构解析提供的信息 用于判断结构中的共轭系统、结构骨架（如香豆素、黄酮）UV谱一致，不一定是一个化合物。应用：确定平面的结构骨架，立体结构的构型、构象。,第三节 结构研究方法,2.红外光谱(Infrared spectra，IR)提供各种官能团的信息如：芳香环:1600-1480cm-1，OH:3000 cm-1,C=O:1700 cm-1.IR相同者为同一化合物。,第三节 结构研究方法,3.质谱(Mass spectra，MS)给出分子量(M+)，给出基团或片段信息，可计算分子式;MS图一致(同一型号仪器，同一条件)一般为同一化合物。,第三节 结构研究方法,4.核磁共振谱（Nuclear magnetic resonance，NMR）氢谱（1H-NMR）化学位移:H的化学环境 偶合常数:判断H与H的关系 积分面积:确定H的数目碳谱（13C-NMR）化学位移：C处的化学环境,第三节 结构研究方法,The End,