中药化学成分的一般研究方法.ppt

中药化学成分的一般研究方法,第二章,一、重点内容：1，中药化学成分的类型，理化性质2，中药化学成分提取、分离的常用方法二、难点内容：1，影响化合物极性大小的因素2，溶剂提取法的应用及注意事项3，结晶法操作及注意事项4，单体纯度的初步判断方法,第一节 中药化学成分及生物合成简介,中药化学成分类型简介（定义、溶解性）,分类,糖类,苷类,醌类,苯丙素类,黄酮类,萜类和挥发油,生物碱,甾体类,三萜类,鞣质,（一）糖类 单 糖：味甜，易溶于水，不溶于有机溶剂。低聚糖：29个单糖聚合，易溶于水，难溶 或不溶于有机溶剂。多 糖：10个以上单糖聚成，多不溶于水，不溶于亲脂性有机溶液。,Haworth式,优势构象式,Fischer投影式,（二）苷类 定义：糖或糖的衍生物与非糖物质(苷元或配基)通过糖的端基碳原子连结而成的化合物。苷元：难溶于水，易溶于亲脂性有机溶剂。苷：能溶于水和极性有机溶剂，难溶于亲脂 性有机溶剂。,芦丁,（三）醌类化合物 定义：分子中具有醌式结构的化合物 游离醌类：溶于苯、氯仿等亲脂性有机溶剂 具有酚羟基，显酸性,可溶于碱水溶液 形成苷：极性增大溶于热水、甲醇、乙醇等,（四）苯丙素类化合物 定义：分子中以苯丙基（C6-C3）为基本骨架单 位构成的化合物。游离香豆素：溶于沸水、甲醇、乙醚等香豆素 具內酯结构，溶于稀碱，加酸环合 香豆素苷：溶于水、醇等大极性有机溶剂,游离：难溶于水，易溶亲脂性有机溶剂木脂素 木脂素苷：水溶性增大,二氢愈创木酸（木脂素）,（五）黄酮类化合物定义：泛指具两个苯环通过中间三碳链互相联 结而成的一类化合物（C6-C3-C6）游离黄酮：溶于甲、乙醇、乙醚等有机溶剂 具有酚羟基，显酸性,溶于碱性溶液 黄酮苷类：溶于水等极性大的溶液,（六）萜类和挥发油萜：由甲戊二羟酸衍生，基本母核分子式符合（C5H8）n 通式的衍生物。游离萜类：溶于亲脂性有机试剂，不溶于水。萜苷类：具一定亲水性，溶于热水、甲醇等极 性溶剂。单萜、倍半萜可随水蒸气蒸馏，具有内酯结构的可溶于稀碱溶液，加酸又析出。,甲戊二羟酸（MVA）,栀子苷,青蒿素,穿心莲内酯,挥发油：又称精油，是一类可随水蒸气蒸馏，与水不相混溶的油状液体物质。成分：萜类（单萜、倍半萜），芳香族化合物 以及它们的含氧衍生物。性质：透明油状液体，具芳香味，常温下挥发。不溶于水，溶于亲脂性有机溶剂。,（七）生物碱定义：存在于生物体内的含氮有机化合物，具有碱的通性，可与酸成盐。游离生物碱：难溶于水，易溶于亲脂性有机溶剂 尤其在氯仿中溶解度大 生物碱盐类：易溶于水和乙醇，难溶于有机溶剂,（八）甾体类化合物 定义：含环戊烷骈多氢菲甾核的化合物。甾体皂苷元：不溶于水，溶于亲脂性有机溶剂 甾体皂苷：溶于水等大极性溶剂，不溶于 亲脂性有机溶剂 皂苷水溶液具有发泡性、溶血性、鱼毒性,（九）三萜类化合物定义：骨架由30个碳原子组成的萜类化合物。三萜皂苷元：不溶于水，溶于亲脂性溶剂。苷水溶液多具有发泡性、溶血性、鱼毒性 含水正丁醇对皂苷溶解度大 三萜皂苷：可溶于水，不溶于极性小溶剂。皂,（十）鞣质定义：鞣质又称单宁或鞣酸，是一类复杂的多元酚类化合物的总称，可与蛋白质结合形成致密、柔韧、不易腐败又难以透水的化合物溶解性：可溶于水、乙醇等极性大的溶剂，不溶于亲脂性有机溶剂。沉淀性：与重金属盐、蛋白质、生物碱沉淀试剂生成沉淀。,小结：即溶于水又溶于醇的化学成分？,成分类型 水 醇类 亲脂性有机溶剂游离生物碱+生物碱盐+苷类+苷元+挥发油+单糖、低聚糖+多糖 鞣质+单糖：无水醇难溶；多糖：60%以上醇难溶。,溶于水和醇的成分：苷类、生物碱盐、鞣质,酸性成分黄酮、蒽醌、香豆素、有机酸、鞣质,中性成分强心苷、皂苷、甾体,碱性成分生物碱,两性成分两性生物碱、氨基酸、蛋白质,极性分类,按溶解性分类,脂溶性成分：苷元、生物碱 水溶性成分：苷、生物碱盐、鞣质,练习：区分下列结构类型,二、各类中药化学成分主要生成途径（了解）,1、一次代谢产物：也叫营养成分。指在植物中普遍存在的维持有机体正常生存的必需物质。,如叶绿素、蛋白质、核酸等,2、二次代谢产物：也叫次生成分。指在特定条件下，以一次代谢产物作为原料或前体，又进一步经历不同的代谢过程所生成的物质。,如生物碱、黄酮、皂苷等,主要研究对象,主要合成途径 生成的化合物类型 乙酸丙二酸途径 脂肪酸类、酚类、醌类 甲戊二羟酸途径 萜类、甾类 莽草酸途径 苯丙素、香豆素、木脂素 氨基酸途径 生物碱类 复合途径 黄酮类,主要的生物合成途径,第二节 中药有效成分的提取分离方法,基本概念1，提取：利用适当的溶剂和方法，将所要的成分尽可能从原料中完全提出的过程。2，分离：将提取物中所含的各种成分一一分开，并将得到的单体加以精制的过程。,一、,一、中药有效成分的提取方法,中药所含有的化学成分较为复杂。要想研究其中的某些成分，必须将它们从中药中提取出来。在进行提取之前，应对所用提取原料的基源、产地、药用部位、采集时间与方法等进行考查，并系统查阅文献，以充分利用前人的经验。中药材料在提取前应进行适当的预处理。为了提高提取效率，可将药材原料进行粉碎，粒度一般以能通过二号筛为宜。,为什么要提取？提取的前期准备！,提取方法,提取方法的不同,（一）溶剂提取法（最普遍方法）1、原理：选择溶剂依据相似相溶原则。根据中药中各种成分的溶解性不同，选用对所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，将所需成分从药材组织中溶解出来的一种提取方法。,1、水2、肥皂3、汽油,2,影响化合物极性大小的因素？A，化合物分子的母核大小(碳的数目)分子量大，碳数多 极性小 分子量小，碳数少 极性大 B，取代基极性的大小 当化合物母核相同或相近时，含极性大的基团的化合物极性大；含基团较多的化合物极性大,酸酚醇胺醛酮酯醚烯烷,思考题,试排列下列化合物的极性大小,A B C D E F,中药化学成分不但数量繁多，而且结构千差万别。所以极性问题很复杂。但依据以上两点，一般可以判定。需要大家判断的大多数是母核相同或相近的化合物，此时主要依据取代基极性大小。,CCl4 C6H6 CH2Cl2 CHCl3 Et2O EtOAc n-BuOH 石油醚四氯化碳苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇水 Me2CO EtOH MeOH,3、溶剂分类,水和亲水性有机溶剂互溶 水和亲脂性有机溶剂不互溶有机溶剂除甲醇不溶于石油醚外均互溶,练习题1、从中药中依次提取不同极性成分应采取的溶剂顺序是（）A.水 乙酸乙酯 乙醇 乙醚 石油醚 B.石油醚 乙醚 乙酸乙酯 乙醇 水 C.石油醚 水 乙醇 乙酸乙酯 乙醚 D.水 乙醇 石油醚 乙酸乙酯 乙醚 E.石油醚 乙醇 乙酸乙酯 乙醚 水2、下列溶剂那个极性最低（）A、EtOAc B、EtOH C、n-BuOH D、Et2O E、Me2CO,B,D,4、选择溶剂的要点：溶剂提取法的关键是选择合适的溶剂*对所要成分溶解度大*沸点适中容易回收*低毒安全,最常用的溶剂为甲、乙醇。甲醇提取效果好于乙醇，但毒性大，一般只用于实验室研究。,5 常用提取溶剂性能特点,亲水性有机溶剂（和水可任意混溶），还有甲醇溶解性强于乙醇，但毒性较大，多用在实验室研究。丙酮溶解性能同乙醇，但沸点低、易挥发，作为提取溶剂不常 用；在分离、精制时常用于脱色，脱水剂。,有机溶剂具有脂溶性，因此除经呼吸道和消化道进入机体内外，尚可经完整的皮肤迅速吸收：神经毒性：以脂肪烃(正己烷)、芳香烃（苯）、氯化烃(二氯甲烷)等脂溶性较强溶剂为多见血液毒性：以芳香烃，特别是苯最常见肝肾毒性：多见于氯代烃类有机溶剂，如氯仿、四氯化碳皮肤粘膜刺激：多数有机溶剂均有程度不等的皮肤粘膜刺激作用，但以酮和酯类为主,PS：有机溶剂毒性,第一类指已知可以致癌并被强烈怀疑对人和环境有害溶剂应避免使用这类溶剂。如在生产不可避免使用了这类溶剂，残留量必须控制在规定的范围内 苯（2ppm）、四氯化碳（4ppm）第二类是指无基因毒性但有动物致癌性的溶剂 氯仿（60ppm）正己烷（290ppm）乙腈（410ppm）二氯甲烷600ppm）甲苯（890ppm）二甲苯（2170ppm）甲醇（3000ppm）环己烷（3880ppm）第三类是指对人体低毒的溶剂 甲酸、乙酸、乙醚、丙酮、苯甲醚、丙醇、丁醇、戊醇、乙酸丁酯、二甲亚砜、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯,毒性试剂分类,6、提取方法 浸渍法 渗漉法 溶剂提取的方法 煎煮法 回流提取法 连续回流提取法,（1）浸渍法：以水或稀醇反复浸泡提取 特点：适于遇热易破坏或挥发性成分及含淀粉粘液质较多的中药。缺点：提取时间长，效率低，水提液易发霉，提取体积大，不适合贵重药材及高浓度的提取。,（2）渗漉法：将中药粗粉装于渗漉筒中，先浸后渗，不断添加溶剂渗过药粉，从渗漉筒下端不断流出渗漉液。各类溶剂均可（常用水或稀醇）。特点：提取效率高于浸渍法，不破坏成分。缺点：溶液体积大（药材10倍体积），时间长。,（3）煎煮法：为中药水提取最常用的方法。必须以水为溶剂。特点：简便，可提取药材中大多数成分。缺点：对含挥发性和加热易破坏成分不适用，不适用含多糖类成分多的中药。,（4）回流提取：有机溶剂 优点：效率较高（较浸渍、渗漉法）缺点：不适用遇热易破坏成分，溶剂消耗大，操作较繁琐7,（5）连续回流提取：用索氏提取器以有机溶剂提取。优点：提取效率高，节省溶剂，操作简单。缺点：加热时间长，不适用遇热易破坏成分,1.冷凝管 2.蒸气上升管3.虹吸管 4.滤纸袋 5.溶剂6.加热,小结溶剂提取法,6，影响溶剂提取法的因素 最主要的是合适的溶剂和方法，此外还有：,（二）水蒸气蒸馏法 适于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，难溶或不溶于水的有效成分提取。主要用于挥发油、某些挥发性小分子生物碱、酚类、醌类、香豆素等具有挥发性成分的的提取。,（三）超临界流体萃取法（SFE）是集提取和分离于一体，又基本上不 用有机溶剂的新技术。超临界流体（SF）：指处于临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上，介于气体和液体之间的、以流动形式存在的物质。特点：SF其密度接近于液体，而粘度又接近于气体，扩散系数虽比气体小，但是比液体要大100倍。,物质的溶解过程包括分子间相互作用和扩散作用。所以物质溶解度与溶剂密度、扩散系数成正比而与粘度成反比，因此超临界流体对许多物质有很强的溶解能力。,常用的介质:最常用 CO2 CO2超临界流体特点：临界温度低（Tc=31.4），临界压力适中（Pc=7.37Mpa）,易操作，价廉，性质惰性，无毒 对比：水Tc=374.2，Pc=22Mpa,CO2超临界流体的溶解能力规律：对亲脂性、低沸点成分溶解能力强，如挥发油。极性基团（如-OH、-COOH）越多，越难提取。分子量越大，越难提取。,缺点对极性大的化合物提取效果较差,优点：1）可在低温下提取，对“热敏性”成分尤其适用 2）无溶剂残留，对作为制剂的中药提取物的提取是一大优势。3）提取与蒸馏合为一体，无需回收溶剂。4）具选择性分离。,改进：添加夹带剂，常用甲醇、丙酮等极性大的溶剂，加入量不超过15%,CO2超临界流体提取法,特点超临界流体密度液体 超临界流体粘度气体,优点1、萃取能力强，大大提高效率2、温度低，热敏性、易氧化分解 的物质不易破坏3、时间短，24小时可完成4、提取物无溶剂残留物5、提取物质量稳定，标准易控制,（四）其他方法：升华法：具有升华性的成分 压榨法：新鲜原料中含量高的成分 超声提取法：利用超声波的空化作用 微波萃取等：利用微波选择性加热性质 半仿生提取法：模拟体内代谢过程提取,二、中药有效成分的 分离精制方法,（一）溶剂法 1、酸碱溶剂法 原理：利用混合物中各组分酸碱性不同进行分离 酸溶：生物碱类成分可与无机酸成盐而溶于水 碱溶：具有羧基，酚羟基等与碱成盐溶于水 强酸性NaHCO3,中等酸性Na2CO3,弱酸性NaOH 内酯或内酰胺结构：可被皂化而溶于热碱水 注意：酸碱的强度、加热温度、与被分离成分接触的时间等。,2、溶剂分配法（萃取法）原理：利用混合物中各成分在互不相溶的两 相溶剂中分配系数（溶解度）不同而达到分离。极性较大成分：正丁醇-水溶剂选择 中等极性成分：乙酸乙酯-水 低极性成分：氯仿（乙醚）-水,（1）简单萃取法 实验室用分液漏斗或下口瓶。一般在水和亲脂性有机溶剂中进行，根据情况，也可用酸水或碱水。中药中成分比较复杂，一般一次萃取分离不出来纯品，需要再配合其他方法。,PS:系统溶剂萃取法 常用来中药化学成分的初分，将总提物分散于水中，依次用石油醚（或环己烷）、氯仿（或乙醚）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别减压回收溶剂得到相应极性的成分。,极性 成分类型 适宜溶剂 强亲脂性 挥发油、脂肪油、苷元 石油醚 脂溶性色素、甾醇 环己烷 亲脂性 苷元、生物碱、树脂 乙醚 有机酸 氯仿 小 强心苷 氯仿 中极性 中 黄酮苷 乙酸乙酯 大 皂苷、蒽醌苷 正丁醇 亲水性 极性很大的苷、多糖 丙酮 氨基酸、某些生物碱盐 甲醇、乙醇 强亲水性 蛋白质、粘液质、氨基酸 水 果胶、糖类、无机盐,溶剂分配法中溶剂系统的选择：1，两相溶剂不相混溶（一般一相为水，另一相为有机溶液）2，混合物中各单一成分在溶剂系统中的分配系数（K）差别越大越好,1、从中药水提液萃取亲脂性成分宜选用溶剂是（）A、乙醚 B、乙醇 C、甲醇 D、正丁醇 E、丙酮2、溶剂法分离中药水提液中成分不宜选用溶剂为（）A、乙醚 B、丙酮 C、正丁醇 D、氯仿 E、乙酸乙酯,A,B,乳化：溶剂萃取过程中，水相和有机相经混合后生成一种稳定的乳状液，产生不易分层的现象。乳化现象常使分离效率降低，严重时会使萃取过程无法进行。,消除乳化现象：（1）搅拌乳化层（2）加无机盐（3）加热或冷却（4）抽滤乳化层（5）分出乳化层，加新溶剂萃取（6）超声乳化层（7）离心乳化层（8）长时间放置（9）连续液-液萃取或液滴逆流萃取（CCD）(DCCC),小常识乳化,（2）pH梯度萃取法：是分离酸性或碱性成分的常用方法。以pH成梯度的酸水溶液依次萃取以亲脂性有机溶剂溶解的碱性成梯度的混合生物碱，或者以pH成梯度的碱水溶液依次萃取以亲脂性有机溶剂溶解的酸性成梯度的混合酚、酸类成分，使后者分离的方法。,（3）连续萃取法（CCD法）：采用连续萃取器萃取。利用两溶液比重不同自然分层和分散相液滴穿过连续相溶剂时发生传质。,（3）CCD（10 50）,（countercurrent distribution，简称CCD）原理：多次、连续的液液萃取分离过程。,（4）液滴逆流分配法（DCCC法）是在CCD法基础上创建的色谱装置，利用流动相形成液滴，通过作为固定相的液柱而达到分离纯化的目的。,二、沉淀法 沉淀法是在中药提取液中加入某些试剂，与其中一些成分生成沉淀，或加入某些试剂后可降低一些成分在溶液中的溶解度而自溶液中析出的一种方法 如果所需要分离获得的成分生成沉淀，则沉淀反应必须是可逆的；如果是不需要的成分，则将生成的沉淀除去，可以是不可逆的沉淀反应。,1、专属试剂沉淀法：某些试剂能选择性地沉淀某类成分，称为专属试剂沉淀法。雷氏铵盐沉淀季铵碱：分离水溶性生物碱 胆甾醇沉淀甾体皂苷：分离甾体皂苷 明胶沉淀鞣质：分离或除去鞣质,2、盐析法 在混合物的水溶液中，加入无机盐至一定浓度或饱和，使某些成分溶解度降低而析出，或用有机溶剂萃取出来。常用NaCl，其它还有MgSO4、（NH4)2SO4等,黄柏丝 5倍量0.2%硫酸浸泡24小时 浸泡液 虹吸上清液下层纱布过滤 滤渣 滤液5倍量0.2%硫酸浸泡24小时 石灰调pH为12,放置30分钟,抽滤 滤渣 滤液 用盐酸调pH为2,加入8%的NaCl 滤液 沉淀（盐酸小檗碱粗品）,3、分级沉淀法：改变溶剂的极性使沉淀逐步析出（加入与该溶液互溶的溶剂，从而改变某些成分溶解度，使其从溶液中析出）。中药提取分离中最常用的为水提醇沉法和醇提水沉法：,1）水提醇沉法：于中药的水提浓缩液中加入乙醇使含醇量达60%以上，可使多糖、蛋白质等沉淀。2）醇提水沉法：于中药的乙醇提取浓缩液中加入10倍量以上水，可沉淀亲脂性成分。,知识驿站水提醇沉 中药水提浓缩液，加入乙醇使达不同量，某些成 分在醇溶液中溶解度降低析出沉淀，分离后得以精 制的方法。操作注意：1，将中药水提液浓缩至1112后加入乙醇 2，慢加快搅：快速搅动药液，缓缓加入乙醇 3，溶液含醇量和可沉淀物质间关系：50%60%淀粉；75%蛋白质；80%85%多糖 优点：可除去大多数的无效成分，操作相对简单 缺点：药物成分有损失；影响疗效；带来制剂上的 不便；成本较高,4、酸碱沉淀法：1）酸提取碱沉淀：用于生物碱的提取分离。2）碱提取酸沉淀：用于酚、酸类成分和内酯 类成分的提取、分离。,5、铅盐沉淀法：利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐沉淀而分离的方法。中性醋酸铅可沉淀具有邻二酚羟基和羧基的成分；碱式醋酸铅的沉淀范围较广，可沉淀含酚羟基和羧基及中性皂苷等。,1通入硫化氢气体法 2硫酸盐或磷酸盐 3阳离子交换树脂法,脱铅方法,（三）分馏法 利用混合组分中各成分的沸点不同而分离的一种方法。用于液体混合物（互溶）的分离。,（四）膜分离法 利用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，对混合物溶液进行分离、分级、提纯和富集的方法。反渗透、超滤、微滤、电渗析均为膜分离技术。其中反渗透、超滤、微滤相当于过滤技术。原理是大分子不能透过膜被截留，而溶剂和小分子物质能透过膜。,透析法也属于膜分离法。透析法分离效果的关键是根据欲分离成分的具体情况选用规格适宜的透析膜。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白胶膜、玻璃纸膜等。,（五）升华法 固体 气体 提取中药中具有升华性的物质 如小分子生物碱、香豆素、游离蒽醌类化合物 常常伴有热分解现象缺点 产率低，不适用于大规模生产,（六）结晶法 定义：由非结晶状态到形成结晶的操作过程。重结晶指由纯度低结晶处理成纯度高结晶的操作过程。（二者从操作角度差别是起始物不同）原理：混合物中各成分在溶剂中溶解度差异 1、结晶的条件（1）溶剂：结晶的关键是选择合适的溶剂。对欲分离的成分热时溶解度大，冷时溶解度 小，而对杂质冷、热时均溶或均不溶 沸点适中 不与被分离成分产生化学反应。,（2）有效成分的浓度：浓度高、纯度高（3）温度：低一些好（4）时间：逐渐析出结晶，速度快易夹有杂质（5）加速结晶的措施：加入晶种 用玻璃棒在器壁上磨擦 制备成衍生物,2、常用溶剂 甲、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等单一溶剂不容易结晶时选择醇-水、醇-醚、醇-丙酮等混合溶剂。,3、操作步骤 提取或分离物 溶于选择的溶剂，加热 成饱和溶液，趁热过滤 滤液 放置析晶（或逐步冷藏，分步析晶）过滤 粗结晶 重复上述过程（重结晶）结晶,4、结晶时注意的一些问题：（1）所得结晶可能是：晶体+溶剂分子 如溶剂为水，则为含水晶体（2）在不同溶剂中结晶形态不同，熔点也不一定相同。所以标注熔点时，应注明溶剂。（3）温度：干燥时应低温，常用真空干燥仪。（4）防潮,（七）色谱分离法 色谱法又称层析法，是一种分离和鉴定化合物的有效方法，其最大的优点在于分离效能高、快速简便。对一些结构性质相似化合物的分离，用经典的萃取法、沉淀法和结晶法等难以达到分离目的时，用色谱法往往可以收到很好的分离效果。色谱法根据分离原理可分为：吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子交换色谱等 根据分离方法又可分为：薄层色谱法（TLC）柱色谱法，纸色谱法（PC）高效液相色谱法（HPLC），气相色谱法（GC）等,1、吸附色谱 原理：利用吸附剂对被分离化合物分子的吸附能力的差异进行分离。,吸附色谱：利用吸附剂对被分离化合物分子的吸附能力的差别而实现分离的一类色谱。,物理吸附特点:无选择性、吸附可逆、快速进行，应用多 如：硅胶 极性吸附剂 氧化铝 极性吸附剂 活性炭 非极性吸附剂化学吸附特点:有选择性、吸附牢固或不可逆、洗脱难，应用少 如：碱性氧化铝 对酚酸类（黄酮、蒽醌）的吸附强 强酸性硅胶 对生物碱的吸附强半化学吸附的特点：吸附力介于上述二者之间，较弱 如：聚酰胺（氢键吸附）大孔吸附树脂吸附原理（范德华引力或产生氢键）分子筛原理（本身多孔性结构的性质决定的）,25,吸附剂（固定相）,溶剂（流动相）,溶质（样品）,25,1）硅胶、氧化铝吸附色谱（极性吸附剂）,特点：对极性物质具有较强的亲和力，极性强的溶质将被优先吸附。溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出较强的吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱。溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加入极性较强的溶剂时，又可被后者置换洗脱下来。,。,25,2）活性炭吸附色谱（非极性吸附剂）,特点：对非极性物质具有较强的亲和力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。溶剂极性降低，则活性炭对溶质的吸附能力也随之降低。故从活性炭上洗脱被吸附物质时，洗脱溶剂的洗脱能力将随溶剂极性的降低而增强。,操作方式 1）薄层色谱：制板 点样 展开 显色 记录 2）柱色谱：装柱 上样 洗脱 收集 浓缩 显色检识 合并 结晶,吸附色谱常见的操作方式是薄层色谱和柱色谱。薄层色谱主要用于化学成分的预试、鉴定及探索柱色谱分离的条件；柱色谱主要用于化学成分的分离制备及含量测定。,薄层层析操作（跑板子）,柱层析操作（跑柱子）,硅胶、氧化铝、活性炭吸附柱色谱法的操作：吸附剂用量：一般为试样量的30-60倍，对极性较小、难以分离者，吸附剂用量可达样品量的100-200倍。硅胶、氧化铝吸附柱色谱，应尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解样品，以利于试样在吸附剂柱上形成狭窄的原始谱带。洗脱用溶剂的极性易逐步增加，但跳跃不能太大。实践中多用混合溶剂，并通过调节比例以改变极性，达到梯度洗脱目的。为避免发生化学吸附，酸性物质宜用硅胶、碱性物质则宜采用氧化铝进行分离。分离酸性（碱性）物质时，洗脱剂中分别加入少量醋酸（吡啶、二乙胺），可收到促进分离的效果。吸附柱色谱溶剂系统可通过TLC进行筛选。但因TLC用吸附剂的粒度细、比表面积一般为柱色谱用吸附剂的二倍，故一般使用TLC展开时使组分Rf值达到0.20.3的溶剂系统。,25,2、凝胶色谱法 凝胶色谱法又称分子排阻色谱法、凝胶滤过色谱法、分子筛色谱法等。是一种以凝胶为固定相分离分子大小不同成分的色谱方法。具有设备简单，操作方便，结果准确，凝胶可反复使用等优点，成为天然药物化学和生物化学研究中的常规分离分析方法。原理：主要为分子筛作用。小分子的化合物进入凝胶颗粒内部，大分子量的化合物被排阻在外部难以进入，因此大分子物质首先被洗出。,26,Sephadex G葡聚糖凝胶,Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶,适用溶剂 水 水及有机溶剂,分离原理 分子筛 分子筛,商品凝胶的种类很多，常用的有葡聚糖凝胶和羟丙基葡聚糖凝胶。,3、离子交换色谱法,原理：混合物中各成分解离度不同而分离。树脂与被交换成分间同种电荷离子的等当量替代作用。以离子交换树脂为固定相，水或酸水碱水为流动相，在流动相中的离子性物质与树脂进行交换而被吸附，再用适合溶剂将被交换成分从树脂上洗脱下来即可。离子交换树脂 离子交换纤维素 兼备离子交换与分子筛作用 离子交换凝胶,中药碱性成分用阳离子交换树脂；酚、酸性成分用阴离子交换树脂，将交换后的树脂通过调整酸碱使吸附物游离，选择适当溶剂将吸附物溶解出即可。应用：主要用于生物碱（盐）、酚类、有机酸及氨基酸、蛋白质、多糖等可离子化成分的分离纯化。操作：装柱前用水充分溶胀，并用酸、碱进行预处理。,NaCl,强碱性（-N+(CH3)3Cl-）弱碱性（-NH2,-NH-）,强酸性（-SO3-H+）弱酸性（-COOH）,4、大孔吸附树脂法,原理：通过物理吸附（范德华力、氢键吸附）有选择性的吸附有机物质。特点：既有吸附性，又有分子筛筛选性 吸附性是范德华力或氢键吸附的结果；筛选性则由其多孔性网状结构引起。,物质洗脱顺序：具有反向性质，被分离物质极性越大，越先被洗脱下来，极性越小，越后洗脱下来。溶剂洗脱力：极性大溶剂极性小溶剂树脂柱的清冼和再生：乙醇、丙酮、异丙醇、2-5%盐酸、2-5%氢氧化钠渗漉法洗脱或回流，最后用水洗至无味操作：预分离成分水溶液上样过树脂柱，依次用水浓度由低到高的含水醇洗脱，则物质按极性从大到小的顺序被洗脱下来。,预处理95%EtOH浸泡湿法装柱95%EtOH洗脱水洗至无醇味,上样湿法上样,洗脱水/酸碱液/低浓度醇除杂质依据吸附力选择洗脱液,再生5%NaOH浸泡洗至中性5%HCl浸泡洗至中性丙酮浸泡/回流,大孔吸附树脂的使用流程,影响大孔树脂吸附作用的因素,非极性树脂吸附非极性化合物极性树脂吸附极性化合物,极性、分子大小,对成分的溶解性、pH值、浓度、流速,常见洗脱剂：甲醇、乙醇、丙酮乙酸乙酯,研究实例,5、分配色谱 原理：利用物质在固定相和流动相之间分配系数（溶解度）不同而达到分离。,原理：将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上，作为固定相，填充于色谱柱中，然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂（流动相）冲洗色谱柱。被分离物质在两相溶剂中相对作逆流移动，在移动过程中不断进行动态分配而得以分离。载体主要有：硅胶、硅藻土、纤维素粉等。,反相色谱应用最为广泛，高效液相色谱多为反相分配色谱,参考书目,1，蔡宝昌，罗兴洪.中药制剂新技术与应用.人民卫生出版社2，芦艳花.中药有效成分提取分离技术.化学工业出版社3，韩丽.使用中药制剂新技术.化学工业出版社,第三节 中药有效成分化学结构 的研究方法,一、结构研究的主要程序,（1）晶形、熔点，D（2）TLC（PC）（3）GC、HPLC,化合物纯度的判定方法1结晶均匀、一致。2熔点明确、熔距敏锐（0.5-1.0）。3TLC(PC):三种以上不同展开剂展开，均呈现单一斑点。4HPLC、GC也可以用于化合物纯度的判断。,一、中药有效成分的理化鉴定1，物理常数的测定：熔点、沸点、比旋率、折光率、比重等2，分子式确定：高分辨率质谱法（HR-MS），可以直接给出分子式。3，结构骨架和官能团确定：,不饱和度u计算公式：I III u=IV-+1 2 2I：一价原子（如H,X）的数目III：三价原子（如N,P）的数目IV：四价原子（C,S）的数目,二、波谱在结构测定中的应用,电磁波根据波长和能量分成的区段,1nm 200nm 400nm 800nm 2.5m 25m 400m 25cm,1、红外光谱（IR)化合物用量只需5-10微克，测定范围5004000cm-1。指纹区在1000cm-1以下，每个化合物有自己的特征指纹图谱；特殊功能区，在1000-4000cm-1，可以确定羰基、苯环、羟基等功能基。,红外光谱仪及红外光谱,4000-1500cm-1特征频率区、1000-500cm-1指纹区,特征区,指纹区,2、紫外光谱（UV）只有在分子结构中具有共轭体系化合物才能在紫外光区产生紫外吸收光谱。UV只提供部分分子信息，单独凭UV不能决定分子结构。,应用：推断化合物的骨架类型 共轭系统取代基团的推断 如：加入诊断试剂推断黄酮的取代模式（类型、数目、排列方式）用于含量测定（以最大吸收波长作为检测波长进行含量测定）,紫外 可见光谱（UV-VIS）共轭体系特征分子中电子跃迁（从基态至激发态）。其中，n-*、-*跃迁可因吸收紫外光及可见光所引起，吸收光谱将出现在光的紫外区和可见区（200700nm）。,200nm 400 700nm,紫外区（UV）可见区（VIS）,30,分子轨道电子跃迁能级图,3、核磁共振(NMR)（1）1H-NMR:提供不同种类氢原子的情况。可提供的结构信息参数，主要为化学位移(),偶合常数(J)及质子数。,化学位移：化合物分子中不同类型的1H核，由于在分子中所处的化学环境不同，而引起的共振谱线位移称为化学位移。化学位移用表示，单位为ppm1H-NMR谱的化学位移范围在020ppm。,（1）化学位移,低场,高场,去屏蔽,屏蔽,不同类型的氢核共振峰,（按间隔的化学键）偶合类型,1）偕偶（2J）,2）邻偶（3J）,3）远程偶和,2J=1215 Hz（sp3）,sp3:自由旋转J=7 Hz 构象固定:0-18Hz，与两面角有关，J90=0 Hz；J180=8 Hz烯型：Jcis=9 Hz Jtrans=15 Hz芳环:Jo=8 Hz,烯丙偶合、芳环间位和对位偶合 J 03 Hz,偶合常数：磁环境不同的两个或两组1H核，在一定距离内会因相互自旋偶合干扰而使共振峰发生裂分，可看到单峰（s），又可能看到裂分后产生的各种不同峰形，如二重峰（d）、三重峰（t）、四重峰（q）、多重峰（m）等。,峰面积：在1H-NMR谱中，峰面积以积分曲线高度表示。每个吸收峰的面积正比于产生该峰的1H核数目。通过比较各峰和积分曲线高度，便可获知产生各峰的1H核数目的相对比例，再借助已知的分子式即可计算出各峰所代表的1H核数目。,1H NMR spectrum of Compound(300 MHz，DMSO),提供信息,NOE差光谱的示意模式图,（1）NOE：两个（组）不同类型质子位于相近的空间距离时，照射其中一个（组）质子会使另一（组）质子的信号强度增强。这种现象称为核Overhauser效应，简称NOE。,特殊方法,特殊方法,（2）重水（D2O）交换：试样中与O、N、S等相连的活泼氢所出现的信号，加进重水后，该信号减弱或消失的现象。判断分子中有无活泼质子。,苄醇的1H-NMR谱（a.加D2O前；b.加D2O后）,500Mhz的核磁共振波谱仪,（2）13C-NMR：碳谱所提供的结构信息是分子中各种不同类型和化学环境的碳核化学位移、13C-1H之间的异核偶合常数等。在利用13C-NMR谱分析结构时，利用度最高的是13C核的化学位移。,1、化学位移 范围为1250ppm，分辨率高。2、积分曲线 与碳的个数成比例，与碳的种类有关。3、偶合常数J 一般认为不存在，因13C自然界丰度比为1.1%，13C相连机遇极小，偶合埋在噪音中，几乎观察不到,4、质谱(MS)测定有机分子的分子量，给出分子式。判断离子峰，提供分子量。分析碎片离子，推断结构信息。目前，高分辨率质谱（HR-MS）可直接给出物质分子量和分子式。,质谱仪,1）电子轰击质谱（Electron Impact,EI-MS）用途：分子离子峰、碎片离子峰缺点：分子量大、难气化、热不稳定的化合物不适用（醇、糖苷、羧酸、多糖、肽）,2）化学电离质谱（Chemical Ionization,CI-MS）（软电离技术）用途：分子离子峰（不稳定化合物）/准分子离子峰缺点：碎片离子峰少，提供的结构信息少,3）场解吸质谱（Field Desorption,FD-MS）（软电离技术）用途：分子离子峰/准分子离子峰，特别适用于难于气化和热不稳定化合物缺点：碎片离子峰少，提供的结构信息少,4）快原子轰击质谱（Fast Atom Bombardment,FAB-MS）（软电离技术）用途：分子离子峰（大分子极性化合物（糖苷）/碎片离子峰得到糖和苷元的碎片离子峰，弥补FD-MS不足。,5）电喷雾电离质谱（Electrospray Ionization,ESI-MS）（软电离技术）用途：准分子离子峰（小分子）/多电荷离子（大分子）,Cotton效应：光学活性分子中若有发色团时，则产生异常的旋光光谱，出现峰和谷的现象。,旋光曲线的类型：平坦曲线；单纯Cotton曲线；复合Cotton曲线；,5、旋光光谱（ORD），圆二色光谱（CD）测定手性化合物构型、构象，确定某些官能团在手性分子中的位置。,6、X射线衍射法 测定化合物结构中键长、键角、构象、绝对构型等细节；X射线衍射法测定大分子物质结构最有力的工具。,The End,