中药化学-提取分离方法.ppt

1-3 第三节 提 取 分 离 方 法,本节主要内容,一.中药有效成分的提取二、中药有效成分的分离与精制（一）根据物质溶解度差别进行分离（二）根据物质在两相溶剂中的分配系数不 同进行分离（三）色谱分离法,一、中药有效成分的提取,提取前的准备 1、考查药材的学名、产地、药用部位、采集时间和方法2、查阅文献 利用前人的提取分离经验3、未知成分 化学成分系统预试验,中药有效成分的提取方法,提取法,溶剂法 相似相溶原理（重点）水蒸气蒸馏法 适于挥发性成分超临界流体萃取法 适于多种物质，尤其是低级性、挥发性成分。,（一）溶剂法,1、溶剂类型,水亲水性溶剂MeOH EtOH Me2CO中等极性溶剂 n-BuOH EtOAC亲脂性溶剂 Et2O pet CHCL3 C6H6,2 提取范围,pet 油脂、蜡、叶绿素、游离甾体及三萜类CHCL3 EtOAC 游离生物碱、有机酸、黄酮 和 香豆素苷元MeOH EtOH Me2CO 苷类、生物碱盐、及鞣质类 水 氨基酸、糖类（黏液质、果胶）无机盐等,3 常用提取方法,（1）浸渍法 适于对热不稳定成分（提取率不高）（2）渗滤法 优于（1）法，但溶剂用量大（3）煎煮法 水提，不适于对热不稳定的成分及挥发油成分（4）回流提取法 适于用有机溶剂提（5）连续回流提取法 用索氏提取器提，溶剂 用量少，提取率高,（二）水蒸汽蒸馏法 此法适于挥发性成分的提取。（三）超临界流体萃取法（SFE）是一种集提取与分离于一体，又基本上不用有机溶剂的新技术。超临界流体是一种处于临界温度和临界压力以上，介于气体和液体之间的流体，具有很强的溶解能力，适于对很多物质的提取。,二、中药有效成分的分离与精制,（一）根据物质溶解度差别进行分离1、结晶、重结晶法原理 利用温度不同引起溶解度 的改变进行分离,（1）溶剂选择,对纯化成分 热溶，冷不溶 对杂质 冷热都不溶或冷热都溶 沸点不可太高，易于回收（n-BuOH不适合b.p太高）对纯化成分不反应,（2）结晶纯度的检查,1、外观：颜色、晶型 2、mp 检查溶点、溶距 3、TLC 三种不同溶剂系统均为一个斑点 4、HPLC 基线稳定的单峰,（3）结晶制备,去杂 制备过饱和溶液 析晶 操作关键：溶解 趁热抽滤 沉淀（热不溶型杂质）滤液 放冷析晶（冷热都不溶杂质）母液 结晶,2、沉淀法（溶剂沉淀）,原理 改变混合溶剂极性使一部分成分沉淀 分类:1.水提醇沉法 去除多糖、蛋白质等 水溶性杂质 2.醇提水沉法 除去树脂、叶绿素等 亲脂性杂质 3.醇提醚（丙酮）沉淀法 可沉淀皂苷,3、酸溶碱沉法 碱溶酸沉法,酸溶碱沉法 提取生物碱碱溶酸沉法 提取酚酸性成分：黄酮、蒽醌等原理 离子态溶解，分子态难溶 而沉淀析出,4、金属盐沉淀法,酸性物 可用 Ca+Ba+Pb+等沉淀碱性物 苦味酸盐沉淀 雷氏铵盐沉淀 中性 Pb(AC)2 可沉淀COOH，邻二酚羟基Pb+碱性 Pb(OH)AC(除以上可沉淀 外)再加使单酚羟基或多元醇沉淀,（二）根据物质在两相溶剂中的 分配系数不同进行分离,1）、液液萃取与分配系数 KD值 原理 利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法 Cu（有机溶剂）上相 KD=CL(水层)下相,例如：A B 两物质 KA=10 KB=0.1CHCL3/H2O 上层（H2O）下层（CHCL3）体积比：1：1萃取平衡后 KA=10 10 1 KB=1 0.1 10此萃取率说明如下：A 大部分在上层（90）仅10在下层氯仿层 B大部分在下层（90在氯仿层）仅10在上层水层因此一次萃取可基本分离开,2）、分离难易与分离因子,分离因子 表示分离的难易程度定义 被分离两物质在同一溶剂系统中分配系数的比值 Ka/kb(Ka Kb)10：0.1 100（一次萃取可完成）10：1 10（1012次萃取可完成）=10:5 2（100次以上萃取可完成）10：9.5 1（无法分离）,3）、分配比与pH对酸碱两性化合物的影响,（1）酸性物质（分子态）HA+H2O A-H3O+（离子态）完全解离时 PH Pka+2 完全游离时 PH=Pka 2 所以 酸性物 PH Pka-2(加碱)（分子态；离子态（盐）游离态）PH Pka+2(加酸),同理：碱性物 PH Pka-2(加碱)酸性物为 HA一般情况 PH 12 时 碱性物为 B,（PH=Pka+PKb）,酸性物质 Pka 小 酸性强 Pka 大 酸性弱碱性物质 Pka小 碱性弱 Pka大 碱性强,4）、萃取操作注意问题,必须是互不相容的两相溶剂 注意温度浓度对KD值的影响注意事项 防止乳化 破乳方法 抽滤，加热，冷冻 长时间放置 加入破乳剂,5）可进行两相溶剂萃取的组合,水石油醚 水苯水乙醚 水己烷水氯仿 水乙酸乙酯水正丁醇不可进行萃取的溶剂组合水乙醇 水甲醇 水丙酮乙醇氯仿 甲醇乙酸乙酯,6）液滴逆流色谱(DCCC)及高速逆流色谱(HSCCC),1分离度大大提高（无载体）特点 2可克服固体载体的吸附消耗 3不会使样品形变污染和色谱峰 畸形拖尾 分离对象 皂苷，生物碱，蛋白质，糖类，酸性化合物等难分离的成分,液滴逆流分配法,4、其他方法,（1）分馏法利用被分离物各成分沸点的不同进行分离。（2）膜分离法小分子可通过生物膜，大分子通不过，适于多糖、肽及蛋白质大分子的精制。（3）升华法适于有升华性的成分的分离。,（三）色谱分离法,1、定义利用混合物中各成分对固定相和移动相的亲和力的差异使之相互分离的方法，又称层析法或色层法。这是一种物理化学分离、分析技术。2、作用可用于混合物的分离，又可用于化合物的定性检识和定量分析。,一色谱法分类,【1】按分离原理分：1、极性吸附色谱法 2、分配色谱法 3、聚酰胺色谱法 4、大孔树脂色谱法 5、凝胶色谱法 6、离子交换树脂色谱法,【2】按操作方法分1、柱层析用于样品分离、精制2、薄层层析（TLC）定性、定量3、纸色谱（PC）定性、定量【3】按两相状态分1、液固色谱2、液液色谱3、气固色谱4、气液色谱,【一】吸附色谱,极性吸附剂硅胶，氧化铝1、分类 非极性吸附剂活性炭 2、吸附规律总原则为相似者易于吸附 极性吸附层析极性强者易吸附 非极性吸附层析对非极性物质吸附牢,极性层析法分离规律,1）吸附规律被分离物极性越强，吸附越牢，极性越弱，吸附越弱。2）分离规律:TLC:极性强的吸附牢，展开距离短，Rf值小 极性弱的吸附弱，展开距离长，Rf值大柱层析:极性强的吸附牢，洗脱速度慢，后洗下 极性弱的吸附弱，洗脱速度快，先洗下,3、极性强弱的判断,（1）极性的概念表示分子中电荷不对称程度 分子偶极矩越大者，极性越强 相关因素 分子极化度越强者，极性越强 介电常数越大，极性越强,（2）常见有机官能团极性顺序:-CH2-CH2-(R-)-CH2=CH2 OCH3-COOR C=O(CHO)-NH2-OH-COOH(3)常见有机溶剂极性顺序与pet C6H6 Et2O CHCl3 EtOAc n-BuOH（=17.5)Me2CO(=20.7）EtOH MeOH H2O,(4)比较原则 a）官能团种类母核相同按官能团极性顺序排列b）官能团数目极性官能团多者，分子极性强 c）官能团排列易形成分子内氢键者 和有空间位阻者,极性官能团的极性下降。d）母核不同，按C/O、N 比值判断，比值高者，极性小，比值小者，极性大。（经验法）,硅胶、氧化铝与活性炭吸附规律的差异,1、硅胶、氧化铝对极性物质吸附牢 活性炭相反对非极性物质吸附牢。（但对于芳 香族吸附大于脂肪族）2、同系物：硅胶、氧化铝 分子量小的吸附牢 活性炭 分子量大的吸附牢3、溶剂介质影响：硅胶、氧化铝在水中活性下降 活性炭在水中吸附性提高,G H,E F,排列以上化合物的极性顺序,1、A、B、C、D极性：A B C D2、E、F、G、H极性：G H F E3、A、B、C、D、E、F、G、H极性：GAHBFECD,排列以上化合物在硅胶G板的Rf展开剂pet：EtOAc（10：1）,1、Rf：D C B A2、Rf：E F H G3、Rf：D C E F B H A G,R R R 黄荚次苷A CHO H H 黄荚次苷B CH3 H H 黄荚次苷C CH2OH H H 黄荚次苷D COOH H H 黄荚苷A CHO（Dglc）2 H 黄荚苷B CH3（Dglc）H单乙酰黄荚次苷B CH3 H COCH3,比较黄荚次苷A、B、C、D的极性 A CHO母核同 B CH3 C CH2OH D C A B D COOH 黄荚苷(A、B)多2个glc，极性 次苷（A，B，C，D）单乙酰黄荚苷B同次苷，但糖上OH AC化，而极性下降。所以 黄荚次苷单乙酰黄荚苷B,氧化铝，硅胶分离极性小的亲3分离对象 脂性成分。（应用广）活性炭分离极性大的亲水性 成分,吸附柱层析法,【二】液液分配柱色谱法,(1)正相分配色谱固定相极性 流动相分类 反相分配色谱固定相极性 流动相 正相分 固定相（液）水配柱色 流动相（液）水饱和有机溶剂 谱 支持剂载体,（2）常用载体纤维素、硅藻土 硅胶（含水10）（3）分离对象亲水性，或水溶性成分，如：苷类，糖类，生物碱类 反相分配层析分离亲脂性成分硅胶表面亲油性表面（不同长度R 取代）,分离规律,正相分配色谱：亲脂性成分易溶于流动相，吸附弱，Rf值大（柱层析先洗下）；亲水性成分易溶于固定相，吸附牢，Rf值小（柱层析后洗下）反相分配色谱：与以上结果相反,【三】聚酰胺吸附色谱法,（1）吸附原理形成分子间氢键 n 聚酰胺分离对象：（2）可形成氢键的官能团：Ar-OH，NH2，COOH，C=O，CHO,NO2,（3）吸附规律：,1 形成氢键基团数目越多，则吸附能力越强.2 已形成分子内氢键者吸附力减弱.3 分子芳香化程度越高者，吸附越牢 4 糖一般不参与吸附 5与溶剂介质有关.形成氢键能力 水中最强 碱中最弱,水 MeOH Me2CO NaOH/H2O 甲酰胺 二甲基甲酰胺 尿素/H2O,溶剂洗脱顺序：,【四】大孔树脂 色谱法,吸附原理范德华引力分子筛分离规律被分离物的极性越大，其Rf值越大 被分离物的极性越小，其Rf值越小 分离对象苷、糖类(多糖)、黄酮、三萜等分 离和收集,【五】凝胶色谱法,1.原理根据物质分子大小差别进行分离，利用分子筛原理进行分离(又名:分子筛过滤、排阻色谱)2、分离规律 分子量大的先洗下、分子量小的后洗下,凝胶色谱示意图,【六】离子交换色谱法,1、分离对象酸性、碱性化合物分离 2.分类 阳离子交换树脂SO3H 阴离子交换树脂 N(CH3)3 3、吸附规律离子化程度高者吸附牢 阳离子树脂碱性强者吸附牢 阴离子树脂酸性强者吸附牢,色谱分离法小结,一、分类 吸附层析吸附能力不同1、按原理分 分配层析分离系数不同 凝胶层析分子大小不同 离子交换层析分子解离 程度不同 柱层析LSC 2、按操作分 薄层层析TLC 纸层析PC,二、吸附规律 硅胶 AL2O3极性大着吸附牢 1、吸附层析 活性炭极性弱着吸附牢 聚酰胺易形成分子间氢键 的吸附牢 正相 亲水性强着吸附牢Rf小2、分配层析 层析 亲脂性强者吸附弱Rf大 反相层析 与上相反,阴离子交换树脂酸性越强吸附 越强，反之吸附越弱,4、离子交换 阳离子交换树脂碱性越强吸附 层析 越牢，反之吸附越弱,3、凝胶层析 分子量小的吸附牢，分子量大 的位阻 小，吸附弱，分子量大的先洗下，分子 量小的后下,三、分离对象 吸附层析分离亲脂性成分如：游离生物碱、甾类和三萜等。分配层析分离极性大的成分如各类苷类 聚酰胺层析 分离香豆素、黄酮、蒽醌类含酚 羟基的成分 离子交换树脂 分离生物碱和酸性成分 凝胶层析 分离分子量差别大的成分,THE END,14 结构研究法,一、结构研究的主要程序：1、确定化合物纯度 mp TLC PC HPLC法 2、测定分子量 MS法：M 3、确定分子式 元素分析法定性、定量分析 高分辨MS法（HRMS）分子量可精确到小数 点后3位数,4、计算分子不饱和度 I/2 III/2 1 I 1价原子（H、D）的数目 3价原子（N、P 等）的数目 4价原子（C、S）的数目（O、S为二价原子，与不饱和度无关，不考虑）,二、光谱测定和解析（MS、IR、UV、NMR）,（一）、MS（质谱）1、MS图谱的表示方法,m/z（碎片峰）推测分子结构,2、作用 M（分子离子峰）确定分子量,3、分类 EIMS（电子轰击）适于M稳定的化合物 FDMS（场解吸）适于难挥发，对热不稳 定化合物，如肽、糖、氨基酸等 FABMS（快速原子轰击）适于高分子、对热不稳定、和强极性化合物如：肽、糖、苷、抗生素、维生素等 CIMS（化学电离）可解析碎片峰少 ESI（电喷雾电离），激光质谱,（二）IR（红外光谱）鉴定分子各官能团,1、IR光谱图示：,分子价键 V（伸缩）在4000625cm1 测得图谱 1、特征频率区（40001500cm1）1VOH（32003700 cm1）游离OH：37003500 cm1 缔合OH：34503200 cm1 VNH（35003300 cm1）（弱）,2VCH（30002700 cm1）VCH3：29602870 cm1V CH CH：3300 cm13 VC C：24002100 cm14VCO（19001650 cm1）17051725 cm1 17401725 cm1,2、指纹区特征 1500650 cm1,（因各分子指纹区不同，IR光谱可代表分子整体结构）1VCCH RCHCH2 990 910 强 RCHCHR（顺）690 中强 RCHCHR（反）970 中强 RCCH2（末端）870 中强,2V Ph-H 单取代（5邻氢）700 770 强 邻位取代（4邻氢）700735 强 间位取代（3邻氢）810750 强 对位取代（2邻氢）860800 强,三、UV可见吸收光谱（200700nm）,1、鉴定分子中不饱和双键和共轭双键的结构（不代表分子整体结构）R（饱和烃）*(无紫外吸收)CHCH（不饱和烃）*(有紫外吸收)PhOH（含杂原子）n*（有紫外可见光吸收）,芳香族化合物香豆素、蒽醌、黄酮等可用UV光谱推测分子结构及取代基类型和数目。2、UV光谱表示方法：,ultraviolet spectra,（四）NMR（核磁共振谱）,化学位移 V样 V标（Hz）(ppm)V仪（MHz）化学位移为相对标量，不随测试仪器改变有机化合物：多数在 0 13 ppmTMS(tetramethylsilane)作内标,去屏蔽效应 屏蔽效应 大 向低磁场移 小 向高磁场移 H 19 ppm 0 ppm C 200ppm 0 ppm,1HNMR（氢谱）,1、1HNMR（氢谱）提供分子中H的数目、类型及化学环境。11HNMR光谱图示：,CH3CH2OH a b C（乙 醇 的 氢 谱 图,不同氢核的大致范围,CH3 0.81.2 CH2 12.5CH 2.53.5 CH 58C CH 23 芳环及芳杂环 69 CHO 910 COOH 1011 活泼H（OH、SH、NH）不定，加D2O后消失,不同氢核的相对位置,影响因素不同 而不同,1、诱导、共轭 2、各相异性 3、氢键、原子快速交换（1）诱导效应 M（推电基）使电子云密度加大，变小，向高场移I（吸电基）使电子云面对减少，加大，向低场移,推电基R（烷烃基）吸电基不饱和双键和含杂原子的基团如电负性 O N C 所以：OCH3 NCH3 CH3（2）共轭效应使电子云密度加大者，变小；使电子云密度减少者，加大 苯酚的p共轭使邻对位电子 云密度加大，减小其间位的电 子云密度减少，加大,（2）各向异性由于电子云密度排布原因使相邻质子,某些位置处在屏蔽区（），电子云密度加大，小（高场）某些位置处在负屏蔽区（），电子云密度减少，大（低场）,（4）氢键使H质子向低场位移，加大（5）质子快速交换反应的影响 OH SH NH2 COOH CHO 为活泼氢，不固定，受浓度、温度、溶剂影响而变化，加D2O后消失,（二）偶合常数 J（Hz）,（1）偶合常数的表示：单峰 S 双峰 d 三峰 t 四峰 q 多重峰 m 2个双峰 dd,（2）各类偶合常数：,苯 环 J邻（O）610 Hz J 间（m)3 Hz J 对（p）01 Hz(一般不考虑）,脂环烃,Jae26 Hz Jaa813Hz Jee28Hz烯烃 J 反（trans）1218Hz J 顺（cis）612Hz,（三）氢谱解析,峰位值 确定H的归属 峰面积（积分曲线、积分值）确定H 的数目 峰形（J、信号裂分数）确定H之间的 相邻关系,2、13CNMR（碳谱）,（1）ppm 0250 偶合常数1JCH：120320 Hz（2）碳谱解析：1 全去偶谱 可获知C的数目和C的 不同化学环境,2偏共振去偶谱：,只保留了C和H之间的偶合，所以峰形的裂分数可以推测C的类型 季碳 S 峰 叔碳 d峰 仲碳 t 峰 伯碳 q峰,（3）常见官能团的C的ppm值：,1 sp3 C20100 sp2 C 100200 sp C701302sp3 CH3 19.8 CH225 OCH35069,3sp2,CC 100120 Ar 100135 ArC 135150 ArO 148199 CO 187202,DEPT 13C NMR,一种特殊技术，可识别碳的类型（CH3,CH2,CH,and C)可确定与碳相连的质子的数目以及各类碳的数目,二维核磁共振谱,1H-1H COSY,THE END,