中药制剂的含量测定.ppt

第四章 中药制剂的含量测定,药物分析教研室 朱丽丽,含量测定的目的和意义,反映其制剂中有效成分或者毒性成分的含量衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量优劣,主要内容,含量测定样品的处理,常用含量测定方法,含量测定方法选定原则及验证,含量测定,第一节 样品的处理,样品基质和成分组成复杂 被测成分含量低主要作用：释放被测组分，制成稳定试样除去杂质，纯化浓缩试样形式符合测定的要求,第一节 样品的处理,样品的粉碎,1,3,样品的提取,2,样品的分离净化,萃取法、浸渍法、回流提取法、连续回流提取法、超声提取法、水蒸气蒸馏法、微波萃取法,沉淀法、蒸馏法、液液萃取法、色谱法、固相微萃取技术、消化法,第一节 样品的处理,一、样品的粉碎目的：取样均匀，提取完全粉碎设备：粉碎机、研钵、铜冲、匀浆机,避免过细避免样品受污染避免粉尘飞散及挥发性成分的损失避免丢弃不易通过筛孔的部分颗粒,第一节 样品的处理,二、样品的提取 对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和某些共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣分离后，再对被测组分进行含量测定。,关键提取完全,萃取法、浸渍法、回流提取法、连续回流提取法、超声提取法、水蒸气蒸馏法、微波萃取法,2.1 萃取法 利用溶质在两种互不相溶溶剂中的分配系数不同，使物质从一种溶剂转移到另一种溶剂中，经过多次萃取，将待测组分萃取出来的方法。相似相溶原理水相的pH影响弱酸弱碱性物质在两相的分配主要用于液体样品中待测组分的萃取分离，多用有机溶剂将水相中的有机成分萃取出来注意防止和消除乳化酒剂和酊剂要先挥发除去乙醇,第一节 样品的处理,长时间静置用滤纸过滤离心分离加乙醚,第一节 样品的处理,2.2 浸渍法 将样品置于溶媒中浸泡一段时间分离出浸渍液。分为冷浸法（室温）和温浸法（40-60）常用溶剂有甲醇、适当浓度的乙醇和三氯甲烷测定方法：全部测定法：过滤滤液蒸干定容测定（低浓）部分测定法：过滤滤液取若干体积进行测定（高浓）优缺点及适用范围：操作简便，适用于热不稳定的样品，提取杂质较少，但是费时（12-24h），费溶剂（10-50倍）,第一节 样品的处理,2.3 回流提取法 将冷浸法中的带塞容器换成回流装置，用单一溶剂或混合溶剂于水浴上加热回流提取，其余操作方法同冷浸法。,主要用于固体样品的提取,优点：1、提取效率高于冷浸法；2、缩短提取时间，每次提取时间为0.5-2小时，直至提取完全为止。缺点：1、提取杂质较多；2、该法对热不稳定或具有挥发性的成分不宜使用。,第一节 样品的处理,2.4 连续回流提取法,样品置索氏提取器中，利用遇热可以挥发的溶剂进行反复提取（相当于总是在使用新鲜溶剂提取），一般提取数小时方可完全。,优缺点及适用范围：操作简便，提取效率高，提取杂质较少，所需溶剂少，受热易分解的成分不宜使用。,第一节 样品的处理,2.5 超声提取法 样品置适当的容器中，加入提取溶剂，放入超声振荡器（超声波清洗器）中进行提取。一般仅需数十分钟。,优点：超声提取能使样品粉末更好地分散于溶剂中提高提取效率和提取速度。缺点：促使化学反应发生（如氧化还原反应、大分子化合物的降解和解聚合作用等）。,第一节 样品的处理,2.6 水蒸气蒸馏法 将含有挥发性成分的样品与水共蒸馏，使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的提取方法。,适用范围：具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏、在水中稳定且难溶或不溶于水的药材成分的提取。,第一节 样品的处理,2.7 微波辅助萃取法 在样品的提取过程中加入微波场，利用微波场的特点来强化有效成分浸出的新型提取技术。,优缺点及适用范围：设备简单、适用范围广、萃取效率高、重现性好适用于热稳定性物质,关键溶剂的选择,第一节 样品的处理,三、样品的分离净化 中药液体制剂：萃取回收溶剂定容测定 中药固体制剂：提纯后纯化分离进行测定,所选测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等,原则：从提取液中除去对测定有干扰的杂质，而又不损失被测定成分。,依据：被测定成分和杂质在理化性质上的差异，结合测定方法的要求。,关键保留有效成分,第一节 样品的处理,沉淀法,2,1,蒸馏法,液-液萃取法,3,4,色谱法,5,消化法,6,固相微萃取技术,第一节 样品的处理,3.1 沉淀法 基于某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液以得到精制的方法,除去试剂的干扰被测成分不能产生沉淀被测成分沉淀后，沉淀经分离后可重新溶解或直接用重量法测定,样品+沉淀剂 沉淀过滤滤液测定 沉淀重量法或溶解后测定,复方益母草口服液中水苏碱的含量测定利用雷氏盐（硫氰酸铬铵）作沉淀剂，在酸性介质中可与大部分有机碱生成难溶于水的配合物与其它杂质分离。,第一节 样品的处理,3.2 蒸馏法 利用某些被测成分具有挥发性，可采用蒸馏法，收集馏出液进行含量测定，或某些成分经蒸馏分解生成挥发性成分，利用分解产物（要求结构明确）进行测定。,适用于具挥发性的待测组分，如挥发油、小分子的生物碱、丹皮酚等最常用水蒸气蒸馏法共水蒸馏法通水蒸气蒸馏法水上蒸馏法利用盐析作用，提高蒸馏效果,第一节 样品的处理,3.3 液-液萃取法,直接萃取法萃取剂的选择 亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚 弱亲脂性的溶剂，如乙酸乙酯、正丁醇等多次萃取（3-4次）调整水相酸度，提取有机酸、有机碱利用盐析作用，提高提取率,第一节 样品的处理,离子对萃取法原理：在适当pH中，某些有机酸（碱）性物质形成的离子与带相反电荷的离子定量地结合成为弱极性的离子对，易溶于有机溶剂，使之萃取分离。适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取水相酸度的控制离子对试剂的选择有机溶剂的选择,起源：1903年俄国植物化学家茨维特,植物色素石油醚溶液,3.4 色谱法,第一节 样品的处理,分离原理：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱操作方式：柱色谱、薄层色谱、纸色谱装柱方法：湿法装柱、干法装柱操作程序：柱的活化；上样；清洗；洗脱。微柱色谱（固相萃取）设备简单、使用方便、快速、净化效率高柱填料：硅胶、氧化铝、键合相硅胶、大孔树脂、聚酰胺、硅藻土、纤维素、离子交换树脂等,固相萃取操作一般有四步：活化-除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。上样-将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。淋洗-除去不需要的组分。洗脱-用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集。,第一节 样品的处理,硅胶、氧化铝,硅胶：作用机制：溶质在吸附剂表面的极性吸附作用。非极性或极性低的杂质先被洗出色谱柱，再用适当极性的溶剂洗脱被测成分，而强极性的杂质仍保留在柱上。特点：通常适于酸性和中性物质的分离；如分离碱性物质，可在展开剂中加入少量稀碱。？氧化铝分离机制：溶质在吸附剂表面的极性吸附作用碱性氧化铝适于碱性和中性物质的分离酸性氧化铝适于分析酸性和中性物质中性氧化铝能将黄酮类成份吸附在柱上，可用于生物碱、苷的分离。,酸性氧化铝对于富电子化合物具有更好的保留性。是使用酸性溶剂预处理过的，具有微弱阳离子特性，表面更易保留中性和带负电荷的物质，不能很好地保留带正电荷的物质。碱性氧化铝表面偏向于保留带正电荷或是含氢键类物质。是用碱性溶液预处理过的氧化铝，具有阴离子特性并有阳离子交换功能，能保留给电子体样品如：中性胺类化合物，相对于中性与酸性氧化铝来说，这种能力要弱得多。碱性氧化铝会有强氢键作用，所以对极性阳离子样品的作用也很明显。,第一节 样品的处理,键合相硅胶（C18或ODS）,作用机制：借助化学反应方法将固定液的官能团键合在硅胶的表面而构成键合相硅胶。有机硅烷与硅胶表面化学键合反应，形成的-Si-O-Si-C-键是对溶剂、热和化学稳定的结构。分开脂溶性和水溶性成分（苷元和苷的分离）纯化水基质体液中憎水性药物洗脱顺序：极性大小,第一节 样品的处理,大孔树脂,极性大孔树脂：为丙稀酰胺聚合物，对极性化合物有相对强的吸附力非极性大孔树脂：为苯乙烯和二乙烯苯的共聚物，对非极性水溶性成分有吸附力特点：表面积大，传质速率较高，具有不同的极性及适于吸附较大分子使用前需要用有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗,测定复方归芪剂中的黄芪甲苷用大孔树脂除去水溶性的多糖杂质，再用30%乙醇洗脱黄芪甲苷。,第一节 样品的处理,聚酰胺机制：主要通过与溶质形成氢键而产生吸附作用用于含酚、酸、醌类药物样品液的净化分离。,测定黄酮时，用样品的乙醇提取液上聚酰胺柱，水洗去部分杂质，以95%乙醇洗脱总黄酮后测定。,第一节 样品的处理,硅藻土、纤维素,亲水性填料机制：分配作用应用：多以水基质液为固定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相，较亲脂的成分从固定相转移到流动相，而被洗脱。萃取率较高（一般大于80%），无浓集作用，但洗脱剂用量较大（一般大于5ml）,第一节 样品的处理,离子交换树脂,特点：可除去样品中的离子，防止组分分解，用于萃取样品液中可解离化合物弱酸性药物：中性和碱性条件下用阴离子交换树脂柱，水及有机溶剂洗脱后，酸性溶液洗目标成分,离子交换树脂中含有一种(或几种)化学活性基团，即交换官能团，在水溶液中能离解出某些阳离子(如H+或Na+)或阴离子(如OH或Cl)，同时吸附溶液中原来存有的其他阳离子或阴离子。即树脂中的离子与溶液中的离子互相交换，从而将溶液中的离子分离出来。,第一节 样品的处理,3.5 固相微萃取技术（SPME）,SPME是在固相萃取技术上发展起来的一种微萃取分离技术，是一种集采样，萃取，浓缩和进样于一体的无溶剂样品微萃取新技术。与固相萃取技术相比，固相微萃取操作更简单，携带更方便，操作费用也更加低廉；另外克服了固相萃取回收率低、吸附剂孔道易堵塞的缺点。主要用于分析挥发性、半挥发性物质。,3.6 消化法 测定中药制剂中的无机元素对样品进行有机破坏，常用于中药制剂中重金属的检查。常用的破坏方法有湿法消化和干法消化法。湿法消化（强酸腐蚀）硝酸高氯酸法：适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏（对含氮杂环类有机物破坏不够完全）。硝酸硫酸法：与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子的测定，不宜采有此法。硫酸硫酸盐法：常用于含砷或锑的有机样品的破坏，破坏后得到三价砷或锑。,湿法消化所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加热）。所用试剂应为优级纯，水应为去离子水或高纯水，同时必须按相同条件进行空白实验校正。操作时应在通风橱内进行。,第一节 样品的处理,干法消化高温炽灼 将有机物灼烧灰化以达分解的目的，本法不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机样品的破坏。常加无水Na2CO3或轻质MgO等以助灰化。加热灼烧时，控制温度在420以下，以免某些被测金属化合物的挥发。经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。,第一节 样品的处理,第二节 常用含量测定方法,化学分析法 可见-紫外分光光度法 薄层扫描法 气相色谱法 高效液相色谱法 毛细管电泳法 原子吸收分光光度法,第二节 常用含量测定方法,一、化学分析法 以物质的化学反应为基础的经典分析方法。化学分析法所用仪器简单，结果准确。主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及含矿物药制剂中的无机成分，如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。化学分析法有一定的局限性，其灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成分准确性不理想。包括重量分析和滴定分析。,第二节 常用含量测定方法,（一）重量分析法 重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。1、挥发法 又叫汽化或干燥法，可测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。如：供试品的干燥失重测定；水分测定均属挥发法；中药制剂分析中灰分及炽灼残渣的测定等。,第二节 常用含量测定方法,2、萃取法 根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的。如冰硼散中冰片的含量测定；地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定；昆明山海棠片中总生物碱的含量测定；甘草浸膏中甘草酸的含量测定即采用萃取法。,第二节 常用含量测定方法,3、沉淀法 将被测组分定量转化为难溶化合物，以沉淀的形式从溶液中分离出来，经滤过、洗涤、干燥、称重，以称量形式转换测定其含量的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。如西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定；苦参片中苦参总碱的含量测定；复方元胡注射液总碱的测定。,第二节 常用含量测定方法,（二）滴定分析法酸碱滴定法：测定生物碱、有机酸、内酯类 沉淀滴定法：银量法：生物碱的氢卤酸盐及有机卤化物 四苯硼钠法：+生物碱白色沉淀 亚铁氰化钾法配位滴定法（EDTA法和硫氰酸铵法）：测定鞣质、生物碱及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂的含量氧化还原滴定法：酚类、糖类及矿物药中Fe、As等,第二节 常用含量测定方法,1、酸碱滴定法 适用于测定中药制剂中所含有的生物碱、有机酸、内酯类等酸、碱组分的含量。直接滴定：对于KC10-8的酸、碱组分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘灵注射液中总生物碱的含量测定、颠茄酊中生物碱的含量测定。间接滴定或非水滴定法：弱有机酸、生物碱或水中溶解度很小的酸、碱。如大山楂丸中总酸性物质的含量测定、草乌注射液中生物碱的含量测定等。,第二节 常用含量测定方法,2、沉淀滴定法 以沉淀反应为基础沉淀滴定法必须满足的条件：1.S小，且能定量完成；2.反应速度大；3.有适当指示剂指示终点；4.吸附现象不影响终点观察。银量法适用于测定中药中无机卤化物、有机氢卤酸盐及有机卤化物 四苯硼钠法适用于测定生物碱的含量亚铁氰化钾法,3、氧化还原滴定法用于测定氧化还原性物质，酚类、糖类、含Fe、As的中药制剂。包括碘量法、高锰酸钾法和亚硝酸银法4、配位滴定法用以测定鞣质、生物碱及含Ca+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂的含量。包括EDTA法和硫氰酸铵法。,应用实例：1、昆明山海棠片的含量测定重量法2、复方陈香胃片的含量测定滴定分析法3、柏子养心片的含量测定滴定分析法,滴定度,每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物质量。中国药典用毫克（mg）表示。,用碘量法测定维生素C的含量时，中国药典规定：每1ml碘滴定液（0.05mol/L）相当于8.806mg的维生素C（C2H8O6）,被测药物,滴定液,滴定度计算,用B来滴定A,滴定液反应的质量,被测药物反应的质量,被测药物的摩尔质量,滴定液的摩尔质量,滴定度计算,用B来滴定A,滴定液,待测液,等于1ml,浓度乘体积=nB,浓度mB,滴定度：单位体积（VB=1 mL）的滴定液相当于被测药物的量，以T 表示，量纲为 mg/mL。,m:滴定液的摩尔浓度（mol/L）a：被测药物的摩尔数b：滴定剂的摩尔数M：被测物摩尔质量（mg）,二、紫外-可见分光光度法 根据物质分子对200-760nm波长范围的电磁波的吸收特征建立起来的光谱分析方法。该法灵敏度高，精度好和操作简便。要求被测成分本身或其显色产物对可见紫外光具有选择性吸收。？定量依据是Lambert-Beer定律？按测定波长数目不同分为单波长光谱法和多波长光谱法。,（一）单波长分光光度法吸收系数法 A=ECL（百分吸收系数，单位g/100ml）朗伯-比尔定律：物质对单色光吸收特性与浓度、液层厚度关系定律 对照品比较法 对照品溶液浓度应与供试品浓度接近（10010）标准曲线法,三、薄层色谱扫描法 样品经薄层分离后，用一定波长的光扫描吸收紫外可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，用薄层色谱扫描仪（光密度计）测量被斑点反射或斑点发射的光束强度的变化而定量，可用于药品的鉴别、杂质检查或含量测定。根据薄层扫描的测定方式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法二种方法。,3.1、薄层吸收扫描法适用于在可见光区、紫外光区有吸收的物质及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。以钨灯和氘灯为光源。在200-800 nm波长范围内选择合适波长测定。定量分析的理论依据 Kubelka-Munk曲线薄层是由许多细小颗粒组成的半透明物体，光照射到薄层表面，除透射光、反射光外，还有相当多的散射光，因此与光照透明溶液不同，样品量与测得值之间呈非线性关系，特别在高浓度区，这样就给定量工作带来困难，为此有以下三种途径来解决薄层上的定量问题。,一、基本原理,a选取曲线中的直线部分用于定量分析在低浓度范围内，样品量与测得值间可存在线性关系，此法最简便，也是在没有线性化功能的薄层色谱仪上最常用的方法，但由于线性浓度范围有限，故应用上有一定限制b.Kubelka-Munk方程光照到散射物质表面，光的行为比较复杂，Kubelka及Munk从理论上推导出简化的方程式，现应用于薄层扫描。,散射参数（SX）SX=0（即薄层固定相无散射作用）时，A与KX呈线性关系，服从Beer定律。SX0时，透射法的A值随着SX增大而增大，而反射法的A值随SX的增大而减小。,c 利用非线性方程定量利用计算机先求出非线性方程，然后在测定样品时将测定值输入计算机，由此方程求出样品浓度。瑞士Camag 公司的薄层扫描仪即根据此原理进行测定，并认为这种方法更为合理，测定值更准确可靠。,3.2、薄层荧光扫描法基本原理：F=KC光源：氙灯或汞灯。灵敏度：最低可测到10-50 pg。适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强度的积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组分的含量代替上式中F与C 进行运算。,薄层色谱的规范化操作1、仪器与材料薄层板；涂布器；点样器材；展开箱（层析缸）显色与检测仪器2、操作方法薄层板的制备；点样；展开；检测；,二、定量分析方法,1、方法学考察 新建薄层扫描定量方法必须进行方法考察，以说明新建方法的可靠性，考察的内容有工作曲线、定量结果的精密度及准确度、统计检验等内容。工作曲线精密度考察准确度考察分离度考察,适于用Kubelka-Munk曲线校直法进行定量校准的仪器检查所选择的散射参数SX值是否适宜。SX值适宜则工作曲线被校为直线，否则，调整SX值再校正，直至工作曲线成直线为止。考察工作曲线是否过原点，以确定采用一点法或二点法定量。确定点样量的线性范围。即使采用曲线校直，也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定点样量的上、下限。,精密度考察 取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以相同点样量平行点6点以上，展开后测定其峰面积，求算相对标准差（RSD），作为衡量定量分析结果精密度的指标。RSD应小于3.0%；需显色后测定的RSD应小于5.0%。式中：为n次测量的平均值，S为标准差。,准确度考察 回收率是衡量定量方法准确度的指标，常用加样回收率（R）来衡量，其值应在95-105%之间，测量数据一般为5-6个。将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，测定各斑点的峰面积，计算各溶液中组分的量，计算回收率（R）。,分离度考察 分离度又称分辨率,为了判断物质的分离情况,常用分离度作为分离效能指标.用R表示.R等于相邻峰保留时间之差与两峰峰宽均值之比。除规定外，R应大于1.0。,2、定量方法 外标法、内标法、追加法及回归曲线定量法 外标法：方法简便，但点样必须准确。外标一点法 工作曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点法定量。只需点一种浓度的标准品溶液，与供试液同板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为：C=F1A 式中：C为组分的重量或浓度，A为测得该组分的峰面积，F1为直线的斜率或比例常数。,外标二点法 工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定量，至少需点二种不同浓度的标准溶液（或一种浓度两种点样量），才能决定一直线,其计算公式为：C=F1A+F2 式中：C、A同前，F1为直线的斜率或比例常数，F2为纵坐标的截距，F1和F2值由仪器自动算出。,注意事项：点样量必须准确，宜用自动点样仪或定量毛细管点样。采用随行标准法，即供试品与标准品交叉点在同一板上；为减小误差，同一薄板上供试品点样不得少于4个，对照品每一浓度不得少于2个；调整供试品与标准溶液的点样量，使其峰面积相接近；,内标法：内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称取一定量内标物加至供试液及标准液中，计算供试品溶液中某组分含量的定量方法。内标物的选择要求是：纯度合乎要求，展开后不得有杂质斑点，否则内标斑点的峰面积将不能代表内标物的量。内标物须为样品中所不含有的成分。内标物不与其它斑点相重叠，分离度合乎要求。为简化计算，内标物在标准溶液及供试品溶液中的浓度应相等。,内标一点法：当工作曲线通过原点时采用内标一点法。内标一点法公式：工作曲线不通过原点时必须采用内标二点法内标二点法公式：式中：C、Cis分别为组分及内标物的浓度或重量，A、Ais分别为测得组分及内标物的峰面积，F1为直线的斜率或比例常数，F2为截距，F1和F2由仪器自动计算并内存，可直接给出样品的浓度或重量。,特点：1.在一定点样量范围内，内标法定量准确度与点样量无关。2.不易找到适宜Rf值的纯品内标物，且溶液配制等操作较麻烦。,回归曲线定量法 将不同浓度（或不同量）的标准溶液与供试液点在同一块薄层板上，展开、扫描;由计算机对所测得的峰面积及相应点样量进行线性或非线性回归;直接由回归方程或回归曲线计算供试液含量的方法;追加法（叠加法）,影响薄层色谱分析的主要因素样品的预处理及供试液的制备薄层色谱的点样技术吸附剂的活性与相对湿度的影响溶剂蒸气在薄层色谱中的作用温度的影响,气相色谱法是以气体为流动相的柱色谱分离分析方法。原理：气相色谱是根据汽化后的试样被载气带入色谱柱，由于各组分在两相间作用不同，在色谱柱中移动有快慢，经一定柱长后得到分离，依次被载气带入检测器，将各组分浓度或质量变化转换成电信号变化记录成色谱图，利用色谱峰保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高进行定量分析的方法。特点：分离效能高、选择性好、灵敏度高，样品用量少及分析速度快等特点，兼具分离、分析的功能。适用范围：适用于热稳定性好的易挥发性或可转化为易挥发性组分的分析。,四、气相色谱,1、塔板理论 将色谱柱的柱效用理论塔板数n或理论塔板高度H衡量，取决于区域宽度（、W1/2、W），其计算公式为,n=,=5.54,=16,H=L/n,适中：tR为组分的保留时间，、W1/2、W分别为组分的标准差、半峰宽和基线宽度。,四、气相色谱,若以调整保留时间tR代替tR，则得到反映色谱柱实际柱效的有效理论塔板数neff。,neff=,=5.54,=16,Heff=L/neff,可见，当tR一定时，峰越窄，则H越小，n越大，柱效越高，分离性能越好。,四、气相色谱,2、速率理论 速率理论研究了色谱过程中各种动力学因素对柱效（峰展宽）的影响，提出了Van Deemeter方程式：H=A+B/u+Cu A、B/u、Cu分别为涡流扩散项、分子扩散（纵向扩散）项、传质阻抗项，从而解释了板高随载气流速而改变，且有最佳流速（Hmin）的现象。速率方程式对于色谱分离条件的选择具有指导意义，它可以说明色谱柱的填充均匀程度、载体粒度、载气种类、柱温和固定液膜厚度对柱效、峰扩张的影响。,四、气相色谱,一、系统适用性试验（1）色谱柱的理论板数n在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR和半峰宽Wh/2，按计算色谱柱的理论板数。若测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、柱填充等），使理论板数达到要求。,四、气相色谱,（2）分离度的计算 分离度是衡量分离效果的指标，以相邻两色谱峰峰尖距对峰宽均值的倍数表示，其定义式为：,两峰基本分离，R1.5两峰完全分离。分离度的影响因素很多，可用基本分离方程式概括如下：,a、b、c分别为柱效项，柱选择性项和柱容量项。,R=,=,R=,a b c,四、气相色谱,（3）重复性 取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%，也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对平均偏差也应不大于2.0%。,四、气相色谱,式中，W0.05h为0.05峰高处的峰宽，d1为峰极大至峰前沿之间的距离，除另有规定外，T应在之间。,（4）拖尾因子T 为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子T是否符合各品种项下的规定，或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：,T=,四、气相色谱,二、实验条件的选择1、固定相的选择 1）气液色谱 固定液：按极性相似、化学官能团相似的相似性原则和主要差别选择。载体：一般为适宜粒度，经酸洗并硅烷化处理的硅藻土。2）气固色谱：固定相大多采用高分子多孔微球（GDX），用于分离水及含羟基（醇）化合物。,四、气相色谱,2、柱温的选择 选择的基本原则：在使最难分离的组分有符合要求的分离度的前提下，尽可能采用较低柱温，但以保留时间适宜及不拖尾为度。,高沸点的样品（沸点300-400），采用1-5%低固定液配比，柱温200-250。沸点为200-300的样品，采用5-10%固定液配比，柱温150-180。沸点为100-200的样品，采用10-15%固定液配比，柱温选各组分的平均沸点2/3左右。气体等低沸点样品，采用15-25%高固定液配比，柱温选沸点左右，在室温或50下进行分析。对于宽沸程样品，需采用程序升温方法进行分析。但需注意的是柱温要低于固定液的最高使用温度。,四、气相色谱,3、载气的选择 主要从对峰展宽（柱效）、柱压降和检测器灵敏度的影响三方面考虑。N2是最常用的载气；载气流速较低时，宜用N2；流速高时，宜用H2、He；较长色谱柱，宜用H2作载气；热导检测器应选用H2、He；氢焰检测器、电子捕获检测器，一般用N2；一般控制载气流速高于其最佳流速。常用的载气流速为20-80 ml/min。,四、气相色谱,4、其他条件的选择气化室（进样口）温度：样品的沸点或稍高于沸点，不超过沸点50检测室温度 100-300 进样量 在检测器灵敏度足够的前提下，尽量减少进样量，通常以塔板数下降10%作为最大允许进样量。5、检测器热导检测器（TCD），氢焰离子化检测器（FID），氮-磷检测器（NPD），电子捕获检测器（ECD）,四、气相色谱,三、定量分析方法 气相色谱常用的定量方法有内标法、外标法、归一化法等。1、内标法为最常用的定量方法优点：可抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因所带来的定量分析误差；缺点：样品的配制较麻烦，有些内标物不易寻找。关键：选择合适的内标物。适用范围：适用于样品的所有组分不能全部流出色谱柱；检测器不能对每个组分都产生信号；只需测定样品中某几个组分含量时的情况。,内标物的选择原则：应是样品中不存在的纯物质。加入量应接近于被测成分。其色谱峰应位于被测成分色谱峰附近且与之完全分离。,四、气相色谱,原理：选择一内标物，将一定量的内标物加入到样品中，根据试样重量W和内标物重量Ws及待测组分和内标物的峰面积Ai、As，求出待测组分的含量。,待测组分百分含量为：,Ci%=,式中fi、fs分别为被测组分和内标的重量校正因子。,四、气相色谱,内标法加校正因子内标对比法内标工作曲线法,Ai/As对C作图,四、气相色谱,2、外标法关键：进样量准确；实验条件恒定。分类：1）工作曲线法：用一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，在完全相同条件下，准确进样等体积的样品溶液，计算其含量；2）外标一点法：当工作曲线截距为零时，可采用外标一点法定量,四、气相色谱,面积归一化法计算：,3、归一化法 关键：要求所有组分均要产生色谱峰。适用范围：通常只能用于粗略考察供试品的杂质含量，一般宜用于微量杂质的含量检查。校正面积归一化法测定各组分的含量。,四、气相色谱,五、高效液相色谱,高效液相色谱法（HPLC）是以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论和实验方法。高压输送流动相，采用高效固定相及在线检测等手段发展而来的分离分析方法，具有分离效能高、分析速度快及应用范围广等特点。适用范围：适用于极性、非极性化合物，离子型化合物和高分子化合物的分离分析。如蛋白质、氨基酸、生物碱、甾体、类脂、核酸、维生素及无机盐类 特点：流动相为液体，黏度大，柱温低，扩散系数很小,五、高效液相色谱,（一）HPLC实验条件的选择1、色谱柱的选择 根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度等因素进行选择。大多数药物可用C18反相（ODS）柱加以分离测定；也可选用正相分配色谱柱（氨基柱、氰基柱）或硅胶吸附色谱柱等；解离药物可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交换色谱分离测定；脂溶性药物异构体的分离测定可采用硅胶吸附色谱柱。,五、高效液相色谱,2、流动相的选择a/反相键合相色谱,五、高效液相色谱,b/正相键合相色谱常采用饱和烷烃（如正已烷）中加入一种极性较大的溶剂作为极性调节剂（如异丙醚），通过调节极性调节剂的浓度改变溶剂强度；常采用二元以上的混合溶剂系统。,五、高效液相色谱,3、洗脱方式等度洗脱是在同一分析周期内流动相的组成保持恒定，使所有组分的k值都处于这个范围内，适用于组分数较少、性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成（如溶剂极性、离子强度和pH值等），适用于分析组分数多、性质相差较大的复杂混合物样品，从而使所有组分都在适宜条件下获得分离。,五、高效液相色谱,4、检测器,5、HPLC前处理（1）流动相的处理溶剂的纯化 选择专供色谱分析用的“色谱纯”溶剂，分析纯或优级纯溶剂在很多情况下也可满足色谱分析的要求。由于不同的色谱柱和检测方法对溶剂的要求不同，有时需进行除去紫外杂质、脱水、重蒸等纯化操作。水一般采用石英系统二次蒸馏水。流动相脱气 HPLC所用的流动相必须预先除去其中的空气，习称脱气，一般在临用前对流动相进行脱气,五、高效液相色谱,超声波振荡脱气、惰性气体（He）鼓泡吹扫 抽真空加热法,五、高效液相色谱,过滤 过滤是为了防止不溶物堵塞流路和色谱柱入口处的微孔垫片，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是过滤，采用0.45m以下微孔滤膜过滤。滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种。,五、高效液相色谱,（2）样品的处理 HPLC分析前需对样品进行预处理，以便将待测物质有效地从样品基质中释放出来，使样品的形式及所用溶剂符合HPLC的要求。待测组分的提取 根据样品成分及组分性质选择合适的提取方法和提取条件。溶剂的挥发 对于液体样品或经处理后得到的样品溶液，若待测物的浓度在定量限以上，且溶剂对HPLC系统没有干扰，可以直接进样分析。但很多情况下需除去溶剂，浓缩甚至干燥样品，除去溶剂的方法有：自然挥散或在氮气流下吹干，适用于小体积样品和挥发性溶剂；减压蒸发，适用于热不稳定样品；冷冻干燥，适用于受热易分解破坏的样品。滤过 样品溶液进样前，需用滤膜抽滤或针头滤器过滤，以有效除去样品溶液中的悬浮物或部分大分子杂质。,五、高效液相色谱,（3）缓冲液的处理新鲜配置（二）HPLC系统适用性试验（三）HPLC法分类及方法其中液-液分配色谱是中药制剂分析中应用最广泛的方法，根据固定相与流动相的极性差别，分为正相色谱和反相色谱两类。正相色谱:流动相极性小于固定相极性的分配色谱法，主要用于极性物质的分离测定；反相色谱:流动相极性大于固定相极性的分配色谱法，主要用于非极性、中等极性物质的分离测定,五、高效液相色谱,化学键合相是将固定液的官能团键合在载体上所形成的固定相。具有化学性能稳定，热稳定性好，一般在pH2-8范围的溶液中不变质，使用过程不流失，载样量大，适于梯度洗脱等特点，已广泛用于正相与反相色谱，离子抑制色谱，离子对色谱。药典中HPLC法所采用的固定相均为化学键合相。以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法.,五、高效液相色谱,（1）反相键合相色谱法反相键合相色谱法是现代液相色谱中应用最为广泛的方法，占整个HPLC应用的80%左右。反相色谱法一般采用非极性键合相，十八烷基键合相（简称ODS或C18）是最常用的非极性固定相，对于各种类型的化合物都有较强的适应能力；流动相通常以水为基础溶剂，再加入一定量能与水互溶的极性调整剂，常用的有甲醇-水、乙腈-水系统。极性调整剂的性质及其与水的混合比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响，流动相的极性增大，洗脱能力降低，溶质的k增大，tR增大；反之，k与tR减小。调整流动相的极性，可控制k值在所要求的范围内（k=1-10），对于结构类似的组分，极性大的组分先出柱。,五、高效液相色谱,（2）正相键合相色谱法 主要用于分离分析溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。氰基（-CN）、氨基（-NH2）和二醇基（DIOL）键合相是正相色谱常用的极性键合相，流动相通常用烷烃（常用正已烷）加适量极性调整剂构成。,五、高效液相色谱,（3）离子对色谱法 直接将离子对试剂加入到流动相中，用以分离离子型或可离子化化合物的方法作为离子对色谱法（PIC或IPC）基本原理:以C18或C8键合相为固定相，用含离子对试剂的有机溶媒-水溶液为流动相，用以分离离子型或可离子化化合物.适用范围:适用于有机酸、碱、盐的分离;用离子交换色谱法无法分离的离子和非离子混合物的分离;在中药制剂分析广泛用于生物碱、有机酸的分析。缺点:离子对试剂价格比较贵.分离条件的选择:离子对试剂的性质和浓度、流动相的pH值及流动相中所含有机溶剂的种类与比例等。,五、高效液相色谱,a/离子对试剂的选择 通常所选用离子对试剂的电荷应与试样离子的电荷相反。,五、高效液相色谱,反相离子对色谱法中流动相pH值的选择原则,b/流动相pH值的控制,五、高效液相色谱,c/有机溶剂的选择 反相离子对色谱法中，甲醇-水、乙腈-水系统是最常用的流动相，流动相中所含有机溶剂的比例越高，组分的k值越小。一般而言，样品组分的疏水性及离子对试剂的疏水性越强，所需有机溶剂的比例越高。,五、高效液相色谱,（4）离子抑制色谱法 原理:由于离子对试剂的价格较贵，对弱酸、弱碱的分离，往往采用离子抑制色谱法。通过向流动相加入少量弱酸（常用醋酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐及醋酸盐），调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法（ISC）。,特点:该方法简便、经济实用、分离效果好，在许多场合可替代离子对色谱法，但重复性较差是其缺点。适用范围:离子抑制色谱法通常用于反相色谱中，适用于3.0pKa7.0的弱酸、7.0pKa8.0的弱碱和两性化合物的分离，以及它们与分子型化合物共存时的分离。,五、高效液相色谱,离子抑制色谱法与离子对色谱法的区别：离子抑制色谱法是向流动相中加入抑制剂，调节pH值，抑制样品组分的解离，使其以分子形式存在。而离子对色谱法是加入离子对试剂，并调节pH值使样品组分尽可能呈解离状态，使离子对试剂的反离子与样品离子结合成中性离子对。离子抑制色谱仅适用于弱碱、弱碱的分离，不适用于有机强酸、强碱的分离；而离子对色谱法对不同强度的酸、碱均适用。,毛细管电泳1、定义：毛细管电泳是离子或荷电粒子以电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中不同组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。2、最基本的仪器结构：高压电源毛细管检测器电极槽进样系统毛细管清洗装置,六、毛细管电泳法,3、电泳谱图,定性分析：谱峰的迁移时间（保留时间）定量分析：谱峰的高度或者峰面积,Fig.2-2 Electropherograms of standard solution,(1)苯胺(2)对甲苯胺(3)对苯二胺,六、毛细管电泳法,毛细管区带电泳（CZE）是毛细管电泳中最基本、应用最广泛的一种分离模式，主要适用于离子分离。电泳流：在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移产生电泳流。,六、毛细管电泳法,电渗流：高压作用下，双电层中的水合阳离子整体地朝负极方向移动，产生电渗流（EOF）。,六、毛细管电泳法,六、毛细管电泳法,一般情况下，电渗流速度（ep）是电泳流速度（eo）速度