中草药有效成分的分离与精制.ppt

中草药有效成分的分离方法 分离的主要目的是?,分离的主要目的是要将有效成分与非有效成分分离；分离的另一重要任务是将上一步分离出的总有效提取物中将有效成分逐一分开。,（一）根据物质溶解度差别进行分离,一、利用温度不同引起溶解度的改变：结晶法 1 关于结晶和重结晶概念：结晶是指由非结晶状态到形成结晶的操作过程。重结晶指由纯度低结晶处理成纯度高结晶的操作过程。二者从操作角度差别是起始物不同。,2 结晶和重结晶操作：提取或分离物 溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤 溶液 放置（冷藏）析晶，过滤 粗结晶 重复上述操作（重结晶）结晶,3 影响结晶的因素：1）结晶用溶剂的选择是最重要因素之一。一般应符合下列条件：（1）要对被结晶成分热时溶解度大、冷时溶解度小；对杂质或冷热时都溶解，或冷热时都不溶解。（2）与被结晶成分不发生化学反应。（3）沸点不宜太高。除用单一溶剂外，中药成分的结晶常用一定比例的混合溶剂。,2）纯度：3）被结晶成分的类型：分子小易结晶；分 子大、含糖多，不易结晶。4）溶液浓度：溶液浓结晶快，但结晶细碎，杂质多；反之结晶慢，但晶形大、纯度高。5）结晶温度和时间：温度低、时间长，结晶好。,二、改变溶剂极性分离,指于中草药提取液中加入某些溶剂，从而改变溶剂极性，使某些成分沉淀而使所要成分与杂质分离的方法。,依据加入溶剂不同，分为：1）水提取醇沉淀法，本法是先以水为溶剂提取药材有效成分，再将提取液浓缩至约1ml相当于原药材12g，再用不同浓度的乙醇沉淀去除提取液中杂质的方法。,工艺依据1、根据药材中各种成分在水和乙醇中的溶解性。通过水和不同浓度的乙醇交替处理，可保留生物碱盐类、甙类、氨基酸、有机酸盐等有效成分；去除蛋白质、糊化淀粉、粘液质、油脂、脂溶性色素、树脂、树胶、部分糖类等杂质。通常认为，料液中含乙醇量达到50%60%时，可去除淀粉等杂质，当含醇量达75%以上时，除鞣质、水溶性色素等少数无效成分外，其余大部分杂质均可沉淀而去除。2、根据工业生产的实际情况。因为中药材体积大，若用乙醇以外的有机溶剂提取，用量多，损耗大，成本高，且有些有机溶剂不利于安全生产。,操作时应注意的问题。,药液的浓缩 水提取液应经浓缩后再加乙醇处理，这样可减少乙醇的用量，使沉淀完全。浓缩时最好采用减压低温，特别是经水醇反复数次沉淀处理后的药液不宜用直火加热浓缩。浓缩前后可视情调节pH值，以保留更多的有效成分，尽可能除去无效物质,加醇方式通常可分二种方式，一为分次醇沉，即每次回收乙醇后再加乙醇调至规定含醇量，使含醇量逐步提高，这样有利于除去杂质，减少杂质对有效成分的包裹一起沉出损失。二为梯度递增法醇沉，即逐步提高乙醇浓度，最后才回收乙醇，其操作方便，但乙醇用量大。不管用何种加醇方式，操作时皆应将乙醇慢慢地加入到浓缩药液中，边加边搅拌，使含醇量逐步提高，杂质慢慢分级沉出。,冷藏与处理加乙醇时药液的温度不能太高，加至所需含醇量后，将容器口盖严，以防止乙醇挥发。该含醇药液慢慢降至室温后，再移置冷库中，于510下静置1224小时（加速胶体杂质凝聚），若含醇药液降温太快，微粒碰撞机会减少，沉淀颗粒较细，难于滤过。待充分静置冷藏后，先虹吸上清液，可顺利滤过，下层稠液再慢慢抽滤，并以同浓度乙醇适量洗涤沉淀，以减少药液成分的损失。,2）醇提取水沉淀法，本法为于醇提取浓缩液中加入10倍量以上水，以除去提取液中杂质的方法。,适用于蛋白质、粘液质、多糖等杂质较多的药材的提取和精制，使它们不易被醇提出。但由于先用乙醇提取，树脂、油脂、色素等杂质可溶于乙醇而被提出，故将醇提取液回收乙醇后，再加水搅拌，静置冷藏一定时间，待这些杂质完全沉淀后滤过去除。,3）醇/醚、醇/丙酮法乙醇提取液中加入数倍量乙醚或丙酮，使皂苷析出，从而与脂溶性杂质分离的方法,三、酸碱沉淀法：,1、酸提取碱沉淀：用于生物碱的提取分离。2、碱提取酸沉淀：用于酚、酸类成分和内酯类成分的提取、分离。,四 专属试剂沉淀法,某些试剂能选择性地沉淀某类成分，称为专属试剂沉淀法。如雷氏铵盐能与水溶性生物碱类生成沉淀，可用于分离水溶性生物碱与其它生物碱；胆甾醇能和甾体皂苷沉淀，可使其与三萜皂苷分离；明胶能沉淀鞣质，可用于分离或除去鞣质等。,（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,1 原理：利用混合物中各单体组分在两相溶剂中的分配系数（K）不同而达到分离的方法。溶剂分配法的两相往往是互相饱和的水相与有机相。混合物中各成分在两相中分配系数相差越大，则分离效果越高。,（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,分离难易与分离因子分离因子：A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。=KA/KB(KA KB)100,一次萃取基本分离 100 10,须萃取10-12次 2，须萃取100次以上KA KB，无法分离,（二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,分配比与pH值pH12，酸性物质呈解离态、碱性呈非解离态,2 方法：1）简单萃取法：仪器，实验室用分液漏斗或下口瓶。一般在水和亲脂性有机溶剂中进行，根据情况，也可用酸水或碱水。中药中成分比较复杂，一般一次萃取分离不出来纯品，需要再配合其他方法。由于成分的复杂性及相互作用，萃取中易发生乳化。破坏乳化的方法有：（1）加热敷；（2）将乳化层抽滤；（3）长时间放置（24小时以上）。,2）pH度萃取法：是分离酸性或碱性成分的常用方法。以pH成梯度的酸水溶液依次萃取以亲脂性有机溶剂溶解的碱性成梯度的混合生物碱，或者以pH成梯度的碱水溶液依次萃取以亲脂性有机溶剂溶解的酸性成梯度的混合酚、酸类成分，使后者分离的方法。,3）逆流分溶法：采用连续萃取器萃取。利用两溶液比重不同自然分层和分散相液滴穿过连续相溶剂时发生传质。此法可克服用分液漏斗多次萃取操作的麻烦。适用于中等极性，不稳定物质的分离。试样极性过大过小，K受浓度、温度影响大、易乳化的萃取溶剂系统不宜,液液萃取纸色谱,PC主要用于选择液液萃取分离物质的最佳方案利用PC（纸色谱）求分离因子（同一溶剂系统）K有机相/水相=1/r（Rf/1-Rf）=Rfa(1-Rfb)/Rfb(1-Rfa)Rfa Rfb,r为纸色谱定数，当色谱滤纸湿重为干重的1.5倍时，r=2,液液分配柱色谱,定义：将两相中的一相涂覆在多孔载体（如硅胶等）上，作为固定相，填充在色谱管中，加入流动相（和固定相不相容的另一相）冲洗色谱柱，使物质在两相溶剂中相对作逆流移动，在移动过程中不断进行动态分配而得以分离，这种方法，叫液液分配柱色谱法。,液液分配柱色谱,正相色谱：固定相极性大于流动相极性，用于分离水溶性或极性较大的成分如生物碱、苷类、糖类、有机酸等反相色谱：固定相极性小于流动相极性，用于分离脂溶性成分常利用薄层色谱选择液液分配柱色谱的最佳分离条件反相色谱的条件为硅胶经化学修饰，键合上长度不同的烃基形成亲脂性表面而成。,液液分配柱色谱,为改善液液分配柱色谱的柱效低，耗时长，达到提高分离速度，缩短分离时间，常施加压力；依压力大小不同，分为：快速色谱（2.02x105Pa），低压液相色谱（20.2x105Pa)各种色谱柱的大体分离规模见教材25页图1-15,4）液滴逆流分配法（DCCC法）：是利用流动相形成液滴，通过作为固定相的液柱而达到分离纯化的目的。特点：不易乳化、无不可逆吸附消耗、无试样变性污染、无色谱峰畸形拖尾、试样可定量回收用于：皂苷、生物碱、酸性化合物、蛋白质、糖类的分离精制,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,吸附：物理、化学、半化学吸附物理吸附：也叫表面吸附，因构成溶液的分子（含溶质及溶剂）与吸附剂表面分子的分子间力的相互作用引起。特点：无选择性、吸附与解吸附过程可逆、速度快。实际工作中用的最多。（如硅胶、氧化铝、活性炭吸附色谱）,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,1、物理吸附的基本规律：相似者易于吸附吸附过程三要素：吸附剂、溶质、溶剂极性吸附剂（硅胶、氧化铝）特点：1）对极性物质亲和力强，极性强的溶质优先吸附2）溶剂极性弱，吸附剂对溶质表现出强的吸附力，溶剂极性增强，吸附剂对溶质的吸附力减弱3）溶质被即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加入极性较强的溶剂，又可被后者置换洗脱下来。4）非极性吸附剂（如活性炭则相反）,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,2、极性强弱的判断：极性：分子中电荷不对称的程度。极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素。1）、官能团的极性强弱，P28表1-32）、化合物的极性由分子中所含官能团的种类、数目、排列方式等综合因素决定极性强弱顺序决定化合物的吸附行为及柱色谱的洗脱规律3）、溶剂的极性大小可据介电常数的大小判定P29表1-5,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,3、可用简单吸附进行物质的浓缩与精制4、吸附色谱柱用于物质的分离 吸附柱色谱 是利用吸附剂对被分离化合物分子的吸附能力的差异，而实现分离的一类色谱。,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,硅胶、氧化铝柱色谱：二者均为最常用的吸附剂。硅胶是一种中等极性的酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。氧化铝有弱碱性，主要用于碱性或中性亲脂性成分的分离，如生物碱、甾、萜类等成分；对于生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、酸、内酯等类型的化合物分离。吸附柱色谱用于物质分离的注意事项：,1）吸附剂的用量一般为试样量的30-60倍，试样极性小、难以分离者，可提高至100-200倍。吸附剂细的颗粒，分离效果好。2）硅胶、氧化铝吸附柱色谱，应尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解试样，以利试样在吸附柱上形成狭窄的原始谱带。如试样在所选溶剂中不溶，可加极性较大溶剂溶解后，再用吸附剂吸收拌匀，60 加热挥尽溶剂，干燥研粉后再上柱。,3）洗脱用溶剂的极性宜逐步增加，但跳跃不能太大。混合溶剂中强极性溶剂的影响较大，不可随意将记性差别很大的两种溶剂混合在一起使用。4）为避免发生化学吸附，酸性物质宜用硅胶、碱性物质宜用氧化铝进行分离。分离酸性（碱性）物质时，洗脱溶剂中可加入适量乙酸（氨、吡啶、二乙胺），以防止拖尾、促进分离。5）吸附柱色谱也可用加压方式进行，溶剂系统可通过TLC进行筛选，一般TLC的Rf为0.2-0.3时为柱色谱分离该组分的最佳溶剂系统,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,活性炭：是一种非极性吸附剂，对非极性物质吸附强。活性炭主要用于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的吸附作用，在水中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,化学吸附：具有选择性，吸附十分牢固，有时甚至不可逆，用得比较少。（如：黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝吸附，生物碱被酸性硅胶吸附）半化学吸附：化合物之间的氢键吸附，介于物理吸附与化学吸附之间。如聚酰胺色谱,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,聚酰胺柱色谱：其与化合物间主要为氢键吸附。主要用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及鞣质类等成分的分离。聚酰胺为高分子聚合物，不溶于水及常用有机溶剂，対碱稳定，对酸不稳定。吸附原理：酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，酰胺键上游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,聚酰胺在含水溶剂中对一般化合物的吸附的规律：化合物中能形成氢键的基团（酚羟基、羧基、羰基）多，吸附强；能形成氢键的基团数目相同，处于对位和间位的吸附力强于邻位的。芳香环和双键多，吸附力强,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,聚酰胺与酚类、醌类化合物形成氢键的能力在水中最强，在含水醇中随醇浓度的增高而减弱，在高浓度醇或其他有机溶剂中几乎不缔合。通常用水装柱，用不同浓度的醇溶液洗脱，也可以用甲酰胺、二甲基甲酰胺、尿素水溶液洗脱。聚酰胺的再生：用10%乙酸、3%氨水、5%NaOH水溶液,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力（弱强）：水-甲醇-NaOH水溶液-甲酰胺-二甲基甲酰胺-尿素水溶液聚酰胺色谱柱的应用：酚类、黄酮类化合物的制备分离（原因：吸附可逆）脱鞣：吸附不可逆,大孔吸附树脂 1 结构与组成：大孔吸附树脂为白色或淡黄色球形颗粒状，粒度多为2060目。组成为苯乙烯，二乙烯苯，或-甲基丙烯酸酯型。其中苯乙烯，二乙烯苯型为非极性树脂，2-甲基丙烯酸酯型为中极性树脂。大孔吸附树脂的结构中包含了许多微观小球组成的网状孔穴结构。,2 特性：理化性质稳定，不容于酸、碱及有机溶剂。对有机物选择性较好。吸附速度快。再生处理方便。3 吸附原理：（吸附性和分子筛性结合）吸附性：大孔吸附树脂本身具有吸附性，是由范德华力或氢键吸附的结果。分子筛性原理：是由大孔吸附树脂本身的多孔性所决定的。通过孔径的化合物根据分子量的大小的不同具有一定的选择性,4 影响大孔吸附树脂分离效果的因素：1）化合物分子极性大小：一般来说，大孔树脂的色谱行为具有反相的性质。被分离物质的极性大先流出色谱柱。2）分子体积大小：在一定条件下，化合物体积越大，吸附力越强。3）吸附剂的表面性质：如比表面积、表面电性、能否与化合物形成氢键、树脂的极性和空间结构。4）洗脱剂：对非极性大孔树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强，对中极性大孔树脂及极性较大化合物，则极性较大溶剂洗脱力强。一般上样后先用水（或酸、碱水）洗去杂质，然后用不同浓度的含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等依次洗脱。,5）pH值得影响（成分具有酸碱性时）碱性物质在碱性溶液中吸附，在酸性溶液中解吸，酸性物质在酸性溶液中吸附，在碱性溶液中解吸6）温度 为物理吸附，低温不利于吸附7）其他因素 预处理、洗脱机流速、柱的高度、树脂的粒径,5 大孔吸附树脂的预处理与再生预处理的原因：含有未聚合单体、致孔剂、分散剂、防腐剂预处理方法：先用甲醇、乙醇、丙酮连续洗涤至加水无白色浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味。再生的原因：吸附的杂质多，会降低吸附能力。再生：用有机溶剂（乙醇、丙酮）洗涤,6 洗脱液的选择：洗脱液可使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等 一般：对非极性大孔树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强，对中极性大孔树脂及极性较大化合物，则极性较大溶剂洗脱力强。,7 大孔吸附树脂的选择：由于选用的骨架材料和引入的基团不同，大孔树脂有选择性吸附的性能。在实际应用中，要达到满意的分离效果，必须根据被分离物的性质选用与之适合的，一定型号的树脂。有研究表明，对吸附量真正起作用的是体积比表面积，即每毫升湿树脂所具有的比表面积。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,1 单味药材成分的分离纯化1.1 苷、皂苷类成分的提取分离主要为总苷的提取，如从白芍中分离白芍总苷，甜叶菊中甜菊苷的提取，天麻中天麻苷的分离；苷与糖的分离，如赤芍中赤芍苷与糖的分离；苷与苷元的分离，如薄盖灵芝中尿嘧啶和嘧啶核苷的分离。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,过去药材中皂苷类成分的提取主要采用溶剂萃取法，但此法大量使用有机溶剂，不但污染环境，而且使皂苷损失较多，并易产生严重的乳化现象，不利于分离，因此现多采用大孔树脂法。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,实验证明，用大孔树脂法精制皂苷，可达到较高的提取率。如用大孔树脂法精制三七总皂苷，提取率在88%以上；将西洋参茎叶的粗制品经过大孔树脂分离富集后，可制得含量达90%的精制皂苷；采用大孔吸附树脂法制得的蒺藜总皂苷，其得量明显高于传统溶剂萃取法。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,若适当改变吸附或解吸条件，则有可能进一步提高药材提取液中有效成分的含量。在提取绞股蓝皂苷时发现，在碱性溶液中有较好的吸附；提取人参总皂苷时，若在提取液中加入适量的无机盐，则可显著增加树脂对皂苷的吸附速度和吸附容量，提取率可从未加盐的70%增至90%以上。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,极性大的皂苷不易被大孔树脂吸附，可被水洗脱。提取刺玫果中的皂苷，水洗大孔树脂除去多糖等杂质，再用95%乙醇洗脱，由薄层色谱检识可知95%醇洗脱液中无皂苷，而水洗液中有皂苷。因此水洗多糖等杂质时，洗的次数不能太多，以免把极性大的皂苷洗下，在实际工作中应用薄层色谱随时监控。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,1.2生物碱类物质的提取分离八十年代初就有应用大孔吸附树脂从三棵针中提取生物碱的报道，其提取率可达97%。生物碱成盐后，在树脂上吸附弱，极易被水洗脱，因此生物碱回收率高。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,有人从树脂的筛选，到吸附和解吸条件的确定，较全面的研究了用树脂法提取喜树碱。实验表明，pH3时，喜树碱易从沉淀中析出；pH10，不稳定。pH 3的氯仿-甲醇（1：1）混合溶剂为一种较好的洗脱溶剂系统。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,以前川芎中生物碱的提取多使用乙醇，并用酸碱处理以分离，但此方法得率低，不适用于工业化生产。而用大孔树脂法制得含川芎嗪和阿魏酸的川芎提取物，含量可达2595%以上。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,1.3 黄酮类物质的提取分离曾有人介绍用DA-型大孔树脂提取四季青总黄酮和从化橘红及其幼果中分离柚苷（二氢黄酮苷类），报道最多的是银杏叶提取物（GBE）的制备。GBE的制备现多用大孔树脂或聚酰胺树脂对黄酮醇苷进行吸附和解吸。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,应用D101吸附树脂精制得含黄酮38%的GBE产品；在银杏叶提取液中加入絮凝剂，滤液在碱性条件下再次进行沉淀处理，所得滤液在酸性条件下上柱，用酸水和酸性25%乙醇洗脱，可得到质量合格而稳定的GBE，其黄酮和内酯含量分别达到26%和6%以上。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,有研究表明，弱极性AB-8型树脂对银杏叶黄酮具有较大的吸附容量，易吸附，易解吸，性能优于其他几种树脂；选用一定比例（体积比为1：1）的D101与聚酰胺混合树脂，选择性与吸附率均得到改善，产品得率提高约1.，黄酮醇苷纯度大于24%。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,中药复方制剂的纯化、制备中药提取纯化研究是改变中药制剂“粗、大、黑”外观和服用剂量过大的关键，也是复方中药制剂现代化研究的热点和难点，对中药制剂的革新发挥着积极的推动作用。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,有实验证明以一定型号的树脂分离纯化复方中药，其纯化后有效成分的保留率大于75%，有效成分或有效部位的含量可提高1014倍，临床用药剂量下降67倍，有明显“去粗取精”的作用。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,有实验证明以一定型号的树脂分离纯化复方中药，其纯化后有效成分的保留率大于75%，有效成分或有效部位的含量可提高1014倍，临床用药剂量下降67倍，有明显“去粗取精”的作用。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,将龟鹿补肾液的生产工艺由原来的醇沉法改为树脂法，以壳聚糖絮凝，树脂吸附达到除杂质目的，制得各项指标均明显升高的口服液；用大孔树脂D1300精制右龟煎液的工艺，考察了影响其精制工艺的主要因素；用大孔吸附树脂法和普通法制备双黄连注射液，前法成品中黄芩苷含量明显高于后法。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,四川泰华制药厂采用WLD型树脂吸附为主，配合其他的提取工艺，制得精制六味地黄胶囊和藿香正气胶囊，通过临床观察，疗效可靠，服用量小，携带方便，现在，两产品已在香港、新加坡注册，并由四川医保公司出口到香港及东南亚地区。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,相对单味中药的提取分离而言，大孔吸附树脂用于复方制剂的研究起步较晚，应用大孔树脂纯化制备复方中药制剂，应进行如下基础性试验研究：,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,在中医药理论指导下，针对具体品种，调研采用树脂分离纯化该品种的研究资料 和数据.在单味中药中有被纯化物的保留率，复方则应有定量、定性指标或药效学指标，说明采用树脂纯化工艺的可行性、可靠性与合理性。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,讨论各类有效成分在树脂上的吸附模型（多分子层吸附或单分子层吸附），拟合必要的数学模型指导实际操作。复方制剂中有效成分复杂，在相同的纯化工艺条件下，不同成分宜用不同洗脱剂解吸，如含有的不同生物碱，用50%乙醇可洗脱小蘗碱，但不能洗脱同时存在的延胡索乙素。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,考察影响吸附和解吸附的各种可能因素。除考察单味中药中应考察的预处理、pH值的调节等因素外，复方制剂中有多种成分共存，在树脂上存在竞争吸附位点等相互间的影响，因此考察影响因素时不能完全与单方制剂等同。加强工业生产上的放大试验研究，以适用于工业化生产。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,大孔吸附树脂法与其他方法的联用 3.1 大孔吸附树脂吸附与超滤联用大孔树脂可吸附精制药液中的有机小分子，而多糖成分不能被吸附，为了保留多糖，将树脂流出液以超滤法截流多糖类成分。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,经考察大孔吸附树脂与超滤技术联用精制六味地黄丸，认为该联用技术既吸附精制了小分子有效成分，又保留了多糖类等大分子强极性有效成分，使精制后的提取物重量只有原药材的4.6%，可有效的减少服用量。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,3.2 大孔树脂法与重结晶法联用该联用法可进一步纯化药液，提高得率。单用DA-201型树脂从甘草浸膏中制备甘草酸，两次过柱洗脱物中甘草酸含量为75%左右，回收率在60%以上，若需含量在80%以上，可结合冰醋酸重结晶法进一步精制。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,3.3 大孔树脂法与分析方法联用为排除其他成分的干扰，准确、快速的用化学或仪器分析法测定复方中药制剂中的有效成分的含量，可先用大孔树脂吸附进行富集纯化。该方法简便、灵敏，重现行好，结果准确。HPLC法测定淫羊藿苷，用大孔吸附树脂预分离，结果平均回收率为98.05%，RSD=1.25%。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,3.4 不同柱色谱的联用在红景天苷的提取工作中，首次将聚酰胺、反相大孔树脂、硅胶及葡聚糖凝胶四种柱色谱联合使用，成功的从大花红景天的乙醇提物中分离制备出克级水平的红景天苷。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,4 结论由此可见，大孔吸附树脂是提取分离中草药中水溶性成分的一种有效方法，小分子糖和无机盐类在水洗过程中被除去，并可用稀醇除去中药中的蛋白质等杂质，因此大孔吸附树脂能除去糖等水溶性杂质及大部分脂溶性杂质。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,在中草药化学成分的提取分离，复方中药制剂的纯化和制备等方面大孔吸附树脂确有其独特的作用，它具有传统分离纯化方法无法比拟的优势：,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,操作简便，树脂再生容易；可重复操作，产品质量稳定，得率恒定；既能选择性吸附，又便于溶媒洗脱，并且不受无机盐的干扰；一般不用有机溶媒，既可保持传统的中医理论用药特色，又能最大限度的保留了其有效成分。,大孔吸附树脂在中药研究中的应用,大孔树脂有着广泛的应用前景，它不仅为中药制剂的质量控制和中药现代化研究提供更有效、更可靠的纯化手段，对中药制剂的革新也起到积极的推动作用。但大孔树脂在中药研究、生产中应用的时间不长，用来制备复方中药制剂才刚刚起步，因此，对它的应用还有一个不断发展和完善的过程，对存在的一些问题还需要作进一步的探讨和解决。相信在今后的科研工作中，会不断总结出新的应用规律，进而推动天然产物的分离和纯化工作的发展。,根据物质分子大小差别进行分离,天然有机化合物分子大小差别大，分子量从几十到几百万，可据此进行分离。常用分离方法有透析法、凝胶滤过法、超滤法、超速离心法。透析法、凝胶滤过法为利用半透膜的膜孔或凝胶的三维网状结构的分子筛滤过作用。超滤法：分子大小不同，扩散速度不同。超速离心法：超速离心作用下具有不同的沉降性或浮游性,根据物质分子大小差别进行分离,透析法、超滤法、超速离心法主要用于水溶性大分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖的脱盐精制及分离。凝胶滤过法可用分离分子量1000以下的化合物。,1 凝胶过滤法凝胶过滤法也叫凝胶过滤色谱、分子筛滤过、排阻色谱。原理主要是分子筛（或反筛子）作用、根据凝胶的孔径和被分离化合物分子的大小而达到分离目的。,样品,凝胶,凝胶是具有多孔隙网状结构的固体物质，被分离物质的分子大小不同，它们能够进入到凝胶内部的能力不同，当混合物溶液通过凝胶柱时，比凝胶孔隙小的分子可以自由进入凝胶内部，而比凝胶孔隙大的分子不能进入凝胶内部，只能通过凝胶颗粒间隙。因此移动速率有差异，分子大的物质不被迟滞(排阻)，保留时间则较短，分子小的物质由于向孔隙沟扩散，移动被滞留，保留时间则较长，而达到分离。,洗脱体积与组分分子量的关系为：Ve=k1-k2lgMk1、k2 为常数，洗脱体积（Ve）取决于分子量（M）大小。M越大，Ve越小，M越小Ve越大（凝胶滤过的洗脱规律）中药中多糖类、蛋白质、苷和苷元的分离可用凝胶色谱。,商品凝胶的种类很多，常用的是葡聚糖凝胶(Sephadex G)和 羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)葡聚糖凝胶(Sephadex G)：系由平均分子量一定的葡聚糖及交联剂（如环氧氯丙烷）交联聚合而成。网孔的大小取决于交联剂的数量及反应条件。交联剂越多，网孔越小，吸水少。反之亦然。Sephadex G-25，G为凝胶，后附数字=吸水率x10，吸水率为：2.5mL/g,羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)为Sephadex G-25经羟丙基化处理后得到的产物，除保留Sephadex G-25原有的分子筛特性，还可起到反相分配色谱的效果。处理：,膜分离技术,原理：选择性透过膜为分离介质，当膜两则存在某种推动力（压力差、浓度差、电位差）时，原料则组分选择性的透过膜，以达到分离、提纯的目的。,膜分离技术,特点：1、分离时无相变，特别适用于中药中热敏性物质的分离、浓缩；2、不耗用有机溶媒，可缩短生产周期、降低有效成分的损失，减少环境污染。3、选择性高4、适用范围广5、可实现连续化和自动化操作6、易与其他生产过程匹配,膜分离技术,类型：按功能分为微滤（0.1um）、超滤（10-100nm）、纳滤（1-10nm）、反渗透（1nm）,膜分离技术,微滤膜：是最早使用的膜技术。以多孔薄膜为过滤介质，使不溶物浓缩过滤的操作。截留的范围约为0.1-10um。应用截留颗粒物、液体澄清、大部分细菌的去除、超滤和反渗透的前处理。,膜分离技术,超滤：超滤是一种以静压差为推动力，根据相对分子质量的不同来进行分离的膜技术。它的孔径范围为10-100nm。他的分离原理近似机械筛。,膜分离技术,超滤技术的优势：（l）减少工序，缩短周期，节约原料（尤其是乙醇），降低成本，生产安全性提高。（2）能在保持原配方成分的基础上提高有效成分的含量,膜分离技术,（3）去杂质效果好，能显著提高注射剂和口服液的澄明度，改善贮存稳定性。（4）除热原效果好。（5）除菌效果好。超滤代替加热灭菌，可避免药液受热分解，并可除去部分色素,膜分离技术,2.应用实例（1）分离纯化，降低药效成分的损失，并可有效地除去非药效成分。（2）浓缩，提高药效成分浓度，减少剂量。（3）制剂生产，包括制备注射液、口服液等。,膜分离技术,2.1在提取中药有效部位和有效成分中 的应用提取黄芩苷可选用截留分子量为600020000的超滤膜，产率可达6.937.68，比传统工艺高出近一倍甜菊苷可采用超薄型板式过滤器和截留分子量为1万的CA膜，脱色性能和除杂效果均较好能很好地解决生产中所出现的沉淀和灌装时起泡的问题。,膜分离技术,2.2 在去除中药注射剂热原中的应用 1982年研制的复方丹参、生脉和茵栀黄等三种超滤的注射液，留样至今澄清度尚好。用超滤法制备丹参注射液和复方丹参注射液，通过化学分析、药效及毒性试验表明，超滤法主要成分阿魏酸含量明显高于原工艺，同时可除去杂质，提高药效，且工艺流程缩短了57天,膜分离技术,2.3 在制备中药口服液中的应用据报道，将口服液用截留分子量为7000的膜进行超滤后，再进行灌装，则产品质量大为改观。不仅澄明度大为提高，口服液中有效部位的含量也有明显提高。,膜分离技术,2.4在制备中药浸膏中的应用采用截留分子量5万以下超滤膜，能够富集中药的有效成分，从而提高了浸膏中有效成分的含量和药效。,膜分离技术,3 技术要点 膜的选择（1）在选择膜时需要充分考虑膜材质和截留分子量等因素。（2）膜材质的选择应考虑膜材质表面性质，膜表面的极性、溶液的PH值等，上述因素对膜的分离效率影响很大。（3）恰当地选择膜的孔径或截留分子量的范围。,膜分离技术,纳滤介于传统分离范围的超滤和反渗透之间，是一种新型的分子级分离技术，它能使90的NaCl透过膜，而使99的蔗糖被截留。由于该膜在渗透过程截留率大于95的最小分子约为 1nm（非对称微孔膜平均孔径为 2 nrn），故被命名为“纳滤膜”,膜分离技术,纳滤膜恰好填补了超滤与反渗透之间的空白，它能截留透过超滤膜的那部分相对分子质量小的有机物，透析被反渗透膜所截留的无机盐。,膜分离技术,纳滤膜的分离性能、特点：纳滤膜通常是带电荷的，荷电纳滤膜可通过静电斥力排斥溶液中与膜上所带电荷相同的离子，因此，荷电膜对物质的分离性能主要是基于荷电效应和膜的纳滤及微孔的分子筛效应。,膜分离技术,纳滤膜技术的特点有:(1)具有离子选择性(2)操作压力低,膜分离技术,纳滤膜的应用1.纳滤膜在食品工业中的应用 在食品工业中，膜分离技术主要是用来对样品进行浓缩、脱盐、脱色、调味和脱除杂质。在植物油加工中，可以用一种纳滤膜将含有游离脂肪酸的大豆油从2%浓缩到45，同时将溶剂正己烷可回收循环使用并将部分酸脱除，该方法较用正己烷直接蒸发法节能50。,膜分离技术,纳滤膜在生物化学和制药工业中的应用在氨基酸生产中的应用 在发酵法生产氨基酸工艺中，透过液经纳滤膜或反渗透膜进行浓缩，可获得高纯度的氨基酸产品，同时节约菌种培养费和降低能耗。又可减少污染。,膜分离技术,抗生素的回收和纯化NF膜可通过两种途径回收和纯化抗生素。一种是先用溶剂萃取，再用NF膜浓缩，该过程由于溶剂循环使用，可节约80%的成本；另一种是先用膜浓缩，再用溶剂萃取，这一方法可提高萃取设备的生产能力，降低溶剂用量。,膜分离技术,多肽的浓缩和纯化目前，用NF膜如MPT膜将肽和多肽直接浓缩，不但可以克服用色谱柱纯化而引发样品被破坏的不足，而且还可除去小分子化合物和盐。NF膜还可用在维生素B12 的回收、浓缩及青霉素制剂的制备等许多生化工程方面。,膜分离技术,纳滤膜在染料工业中的应用在 18 MPa的压力下，用一种管式聚矾膜可将相对分子质量为781的一种染料溶液脱色，对该染料的截留率可达 9799，通量达 0608立方米。,膜分离技术,反渗透为借助外加压力的作用使溶液的溶剂透过半透膜而阻留某些溶质，它是分离、浓缩、提纯的有效手段。它的孔径范围一般为1nm。能有效除出微粒、胶体、细菌、热原、有机物和大部分离子。,膜分离技术,基本原理当纯水和盐水被理想半透膜隔开，理想半透膜只允许水通过而阻止盐通过，此时膜纯水侧的水会自发地通过半透膜流入盐水一侧，这种现象称为渗透，若在膜的盐水侧施加压力，那么水的自发流动将受到抑制而减慢，当施加的压力达到某一数值时，水通过膜的净流量等于零，这个压力称为渗透压力，当施加在膜盐水侧的压力大于渗透压力时，水的流向就会逆转，此时，盐水中的水将流入纯水侧，上述现象就是水的反渗透（RO）处理的基本原理。,膜分离技术,RO（Reverse Osmosis）反渗透技术是利用压力差为动力的膜分离过滤技术，源于美国二十世纪六十年代宇航科技的研究，后逐渐转化为民用，目前已广泛运用于科研、医药、食品、饮料、海水淡化等领域。,膜分离技术,RO反渗透膜孔径小至纳米级（1纳米=10-9米），在一定的压力下，H2O分子可以通过RO膜，而源水中的无机盐、重金属离子、有机物、胶体、细菌、病毒等杂质无法通过RO膜，从而使可以透过的纯水和无法透过的浓缩水严格区分开来。,膜分离技术,一般的自来水经过RO膜过滤后的纯水电导率5s/cm（RO膜过滤后出水电导=进水电导除盐率，一般进口反渗透膜脱盐率都能达到99%以上，5年内运行能保证97%以上。对出水电导要求比较高的，可以采用2级反渗透，再经过简单的处理，水电导能小于1s/cm）,符合国家实验室三级用水标准。再经过原子级离子交换柱循环过滤，出水电阻率可以达到18.2M.cm，超过国家实验室一级用水标准（GB 668292）。,膜分离技术,目前的主要困难是研制价格便宜、稳定、长期受压无损的反渗透膜。中国从21世纪初开始掌握自主反渗透膜生产技术，在国家的大力支持下，将该计划列入国家计委高新技术产业化重点发展专项计划，由国家海洋局下的杭州水处理研究开发中心的子公司杭州北斗星膜制品有限公司承担并研发成功。目前反渗透膜市场95为进口膜，国产膜只占据了5%左右的市场，中国的反渗透技术还有很长的路要走。,膜分离技术,应用范围主要应用制备各种高品质的医用水、注射用水、医用透析水，也可用于脱盐 纯化太空水、纯净水、蒸馏水等制备；酒类制造及降度用水；医药、电子等行业用水的前期制备；化工工艺的浓缩、分离、提纯及配水制备；锅炉补给水除盐软水；海水、苦咸水淡化；造纸、电镀、印染等行业用水及废水处理。,根据物质离解程度不同进行分离 离子交换色谱。离子交换反应的原理是树脂与被交换成分间同种电荷离子的等当量替代作用。以离子交换树脂为固定相，水或酸水、碱水为流动相，在流动相中的离子性物质与树脂进行交换而被吸附，再用适合溶剂将被交换成分从树脂上洗脱下来即可。,根据物质离解程度不同进行分离,利用离子交换剂与溶液中的离子发生交换作用而使离子分离的方法，称为离子交换分离法。20世纪初期，工业上就开始用天然的无机离子交换剂泡沸石来软化硬水。但这类无机离子交换剂的交换能力低，化学稳定性和机械强度差，应用受到很大限制。近年来合成了有机离子交换剂离子交换树脂，基本上克服了无机离子交换剂的缺点因此离子交换分离法在生产和科研各方面得到了广泛的应用。,根据物质离解程度不同进行分离,离子交换树脂的结构和性质（一）结构离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物。网状结构的骨架部分一段很稳定，不溶于酸、碱和一般溶剂。在网状结构的骨架上有许多可被交换的活性基团。根据活性基团的不同、离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。,根据物质离解程度不同进行分离,离子交换树脂的结构和性质1.阳离子交换树脂阳离子交换树脂具有酸性基团，如应用最广泛的强酸性磺酸型聚苯乙烯树脂，它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合，经浓硫酸磺化而制得的聚合物。这种树脂的化学性质很稳定，具有耐强酸、强碱、氧化剂和还原剂的性质，因此应用非常广泛。,根据物质离解程度不同进行分离,各种阳离子交换树脂含有不同的活性基团、常见的有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)和羟基(-OH)等。根据活性基团离解出H+能力的大小不同，阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种。例如含-SO3的为强酸性阳离子交换树脂，常用R-SO3H表示(R表示树脂的骨架)，合-COOH和-OH的弱酸性阳离子交换树脂，分别用R-COOH和R-OH表示。,根据物质离解程度不同进行分离,强酸性阳离子交换树脂应用较广泛，弱酸性阳离子交换树脂的H+不易电离，所以在酸性溶液中不能应用，但它的选择性较高而且易于洗脱。,根据物质离解程度不同进行分离,2.阴离子交换树脂阴离子交换树脂与阳离子交换树脂具有同样的有机骨架，只是所联的活性基团为碱性基团。如含季胺-N(CH3)3的树脂的OH-易电离，称为强碱性阴离子交换树脂，含伯胺基(-NH2)、仲胺基(-NHCH3)和叔胺基(-N(CH3)2)的树脂为弱碱性阴离子交换树脂。这些树脂水化后分别形成R-NH3OH、R-NH2CH3OH、R-NH(CH3)2OH 和R-N(CH3)3OH等氢氧型阴离子交换树脂，所联的OH-可被阴离子交换和洗脱,根据物质离解程度不同进行分离,阴离子交换树脂的化学稳定性及耐热性能都不如阳离子交换树脂稳定。,根据物质离解程度不同进行分离,(二)性质1交联度 离子交换树脂的骨架是由各种有机原料聚合而成的网状结构，例如强酸性阳离子交换树脂的合成过程，是先由苯乙烯聚合而成为长的链状分子，再由二乙烯苯把各链状分子联成立体型的网状体。这里二乙烯苯称为交联剂，树脂中所含交联剂的百分率称为交联度。如二乙烯苯在原料总量中占10%。则称该树脂的交联度为10。,根据物质离解程度不同进行分离,树脂的交联度越大，则网眼越小，交换时体积大的离子进入树脂便受到限制。但提高了交换的选择性：另外，交