实时定量PCR实验故障排除.docx
VpI&I ¥ WpisdtM.? Cojjpo仪11 f Aug>L ifi-cat ChD FLotf Standard Cuxve- / Diaaaciatiaa /R±pDri Q.ai4.|Delit RnCyclIrtsctcc#|ni&l阳套 Setdii;F W加 Ct而 Hinu ClTiiresPrtLd! fi.：B43HL A.I1C4 EmWLik忙KaJiUAL蹈M】Lr亡313-1 厂Ind巨实时定量PCR实验故障排除扩增曲线同AHI Prism TO。5DS Softuari： 一 RNageF (AbsoLirt做 Quantificalion)Fl EL lie- lieir coIe Ijistrunent Analysis Lnd=w Eftlp 顶I #虬号艮E! 口与 El七 F:P， n.成：rmwiirt KmM MAB I Prism TOGO SD5 Software 一 RNqspP Absodulp Quajit if ieatiunlT原始数据I- n| x|-Hhl封3 Elie IIcr IdoIs Iritrmitnt final fs Li fiindw Help El Q事以J回寸曰*回VSe t u.p ¥ 匚就:tu里止,IJi ii 11 l * $SB E i冷 ¥、门 rmnu n f T °113 V 口owWWW Wwmwmi她mFAMROXWJW-TAMRAH 31 n 2i 1?1113151718 Z1 F汕 P K« P TBHM1911 一 u°¥a!lJujVFzcreKWKEIIBHlll!ft 4-xad.sy £ Iks r S3ia n Jr *Ajrri p-rapiraig £. 口】uroriBoijcdnY J ioqudoidj k * j J a ia J； J 4.aipuxi4su jdh|.A/4 |Q -4 3 0 0 句 0 孔费口 tfLJI UOpUll H播AL刨另 JUlDJ)SI.-fI SMl fAI 0H2 flxp |UUUVJ|.|L>UWI/)JjiLpsqvj 冲火牌MB旧璃 SUS flOO：昏飘寅f阳刊溪旻ejioeds<L'i3n 顽。Software -RNtJseP (Also utc Quii»titicfltiflnVI<x>Lc航以时旬J£Lrid HMp(S' Li EJ. E3 S ?71 时rwg1 玳Ko Saul t i a f5毗四也。土匕整iJ.Ifjjf典t黔 Pl 鸿，沮 gdwrd Curg _饷 pwoclait £5 Yft*g一或3LcqCO没有扩增曲线Amp Plot Component原始数据只有1个循环Spectra1. 收集数据的步骤只有一个循环，只收集了一个数据点2. 电脑为了节省电源而休眠，通讯中断，1个循环后的数据丢失原因1： PCR参数设置错误原因2：硬盘休眠.Bf僖质耳乍控iUi由I鱼SncMOO SpkcE<pnli rrcJlnijiySalf!用石戛.Ji?sniitiili-岛底H H n：从原始数据找原因从第1-第9个循环，ROX的信号升高并逐渐下降。在所设定的4-13基线范围内，ROX信号值是变化的，而FAM的信号值基本上是固定的，经过 FAM/ROX的校正后，比值自然不相等，所以基线不是水平的直线，而有下滑部分。ROX的信号变化与所用试剂的质量有关。应该取10-20为合理的基线范围。PlgkteyMp*otTEkPCoiBir>Qn&mY Auiplifiomticm Flot V Standard Curv舂 Y Di臼EooiatLon22DD.aOzjon.ao1SDD.DQ1000.00UDD.DQ1200.001DDD.DDi二 omDgrr领.皿bDO.OO4DD.D0解决方法修改基线范围为10-20，重新分析。ABpdifioation Flc丁 StandNrd Curv自 Y Dissgooiation 1 R令giG)mpo<i 黛 rt22DD.DQ3DDD.DQ1800.001600.00£为忠014DD.D09D0.D0bDO.OO重新分析的结果基线范围取10-20,重新分析后的图谱。第1-9循环的信号为负数，由于试剂质量引起。心总基0=0.&口兮必trETyCcHmDQn&niY ApidI ifioaiion Plol ) Siandara Curve / Di.日日。Diatiom 1 Reg】400.002200.003DDD.DQ1BDD.D01600.0014DD.DQ1200.001DDD.DDgmDonmrt虱 11 13 M 17 IQ 31 23 25 17 2S 31 33 S5 37 龙3增曲线分成两段扩增曲线断裂原因：基线的终点大于CT值,通常是因为模板DNA浓度偏高，CT值 15,而基线仍然取3-15,其中包含部分扩增信号，导致标准偏差偏大，阈值过高解决方法：减小基线终点，至CT值前4个循环，重新分析数据样品浓度跨度太大直线扩增曲线原因：探针部分降解V形扩增曲线EiraurOMiJiiQIKM1CH时E皿1»riSriL Itas Solti袂T，LO&g” l5jiJ.iLn.-iIfinEtw*:al-Baer tm甜牡】皿群1TM rL展 aulmbled Ln.linrtgrOptiwisi-iw Htftn.； |i 习 Cl .WculT口 |印 jaeaL| ikt：-3 yT-ILwIa：PZMLtMjfjETXE XTHrtfUlRPTKU V ML；检 E, 1 Ifn 11 :1 *! m PI >1双击纵坐标，打开Graph Settings关闭Auto Scale设置到正常范围0-10000OK.8_ -. FL JJ.史-zr A* mmjnmn.眼口 Hpciw ids? w号里 Ena *目罕tintf. IxrtfliE. kJ.; U i>l /L伺 7500 SystEiSPS Software OW4151 (找b迎into 导日冏既口仗小；建议将纵坐标设置到适当范围,以观全貌F Rfe 即w Toois JiruYierit AnE wndoxi 成口.醇 m:%阊.回二i wt弓亡加口事心让uritptYCllXTiT Y 0：L!5GPi"l：Lim FcTJUEt »扩增曲线是一根水平直线说明没有检测到信号，提示实验失败1 ? 3 J| 5 e. ? 8 y I a 1 I 1 ? I 314 1 *.1 e. I ? 181020 21 2 J2 3 24 23 IT 28 2Q 30 31 33 33 34 M 3G 3T 38 ?34 D扩增微弱或者信号很弱晶tup Y Instruumrit YResuLtsFlatm ? Spectral yCcmiDunent Y Amulif icati口口 Plot：| dard3200 DOCoimponent2400.002D00.D01 600.00Component(s)| P :：M| P KOX1 200 DOCycles/，：tup * Inmt二utr:?尹i io JComponent命oulvusamnKooo5DQD.DQ4D00.D03000.002D0D DO1 OOD DO13 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 3? 3943 J(5-Component (s)-| P FAM| P BOX/Pjjite r : /Component y j' mi J if?i cat k.i HlotCyclesROX信号不稳定/PlBt令 Y Spectra FCcumDQnnt Y AsAlificmiTn Flot V $：an<l：ard lurv令 f DLugioDl-tLon1400.00IS'00.00IODO.OOComDon 专 rt8DD.DD13 fi 7® 1113顽 0.0。3医¥o_ll扩增曲线不光滑原因：信号太弱解决方法使用高质量的探针补救方法：1.7000的SDS软件升级到V1.12.关闭ROX校正，重新分析数据Well nsg&ir¥tll =): D IITE4Ii霞V<k言*1普言T4£E1 ty7F1Knx皿心standAid扑+血nTEC JO1ICLtnliiownTT1K HC£flK(XU0E)ItnliiowrirTEEUJETAJD.JIUdJc 皿 van喝叮伫BsJiiE：r如以njiid letec t or. .Passive关闭ROX校正的效果1600-400关闭Ko"校ir20001200800400013579 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39ROX帮助故障诊断(1)现象：重复性很差Cycle Number正常的原始数据 Sekp & EMtmteI X附壹亦归 t Piffle A XCcmP°ncnrt K AnipmMticnPbi /, Etan(mi 匚此典 X 口母叫廿的n X,Eqwrt /Cumpcinm13D00 0010000.00B000 006000 004000 00CompoiErE)17 FAM|7 TAMR417 ROX2DDD 009 11 13 15 17 19 21 23 25 2J 29 31 33 35 37 39EULJual口 m 山03-0 00Cycles原因：盖子未盖紧，溶液蒸发 ScMj & InstruTcni XrctuHw，,=、t Ptale乂 =1»01住 X珈e口口昵m £ A呻M由izn Pkyl g StancariJ 如1网 乂。信心Alton / Retort /ComgrientssssuZ-Caiiporierfe R7 FAM V叩僵 F HUK排除蒸发的数据后ROX帮助故障诊断(2)现象：山坡形扩增曲线 S Pjfl.P E引物二聚体 SYBR Green I®化学，Dissociation curve 试验推荐措施：提高引物设计质量，避免形成引物二聚体补救措施：优化引物浓度和退火温度 也许：专设80度步骤收集信号?
