实时荧光定量PCR(RT PCR).docx

实时荧光定量PCR (RT-PCR)关键词：实时荧光定量PCR RT-PCR原理荧光阈值Ct值标准曲线的绘制荧 光扩增曲线实时荧光定量PCR在PCR反应中，无论是定性还是定量分析，分析的都是PCR的终产物。但是有时 候想知道的却是未经PCR放大之前的起始模板量，RT-PCR应用而生。1. RT-PCR 原理计防 Frirwex T TT 观mg角善犬物困1 I，I I I K I i I I E I I Ii刖油渔火.摞针ESS械魅我立i'O+ Tr 1' t 1 T E I I i II L I I ! ITaqMan探针图1原理图图2 Taqmen探针如图2 Taqmen探针，5端标记有报告基团R可发出荧光信号，3端标记有 荧光淬灭基团Q可吸收荧光信号。探针的本质就是一寡核苷酸链。如图1在PCR的反应过程中加入一寡核苷酸链(DNA/RNA)，我们称之为探针。 当探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收，从而不被检测出来。 当PCR扩增至探针所在位置时，Taq DNA聚合酶具有的核酸外切酶活性会将探针 5端的报告基团切断，使其远离探针本身，这时产生的荧光信号就不能被淬灭 基团吸收，而被仪器检测出来。每扩增一条DNA链就会有一个荧光分子产生，通 过荧光信号的积累量实时监测整个PCR反应中每一个循环扩增产物量的变化，最 后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概 念：荧光阈值和CT值。2. 荧光阈值(threshold)荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，PCR反应的前15个循环的荧 光信号作为荧光本底信号，一般荧光阈值的默认设置值是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。3. Ct 值Ct（Cycle threshold）:每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环 数。不同浓度的起始模板到达荧光设定阈值的循环数不同，即Ct值不同。得到 Ct值，即可通过标准曲线计算出起始模板量。荧光阈值和Ct值得关系（如图1 Ct值的确定）。模板DNA量越多，荧光达到阈 值所经历的循环数越少，Ct值越小（如图2）。如果用已知起始拷贝数标准品作 标准曲线，横坐标是起始拷贝数的对数，纵坐标是Ct值。只要获得未知样品的 Ct值，就可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。cycle （fltSF数）图1如图Ct值是荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数图2如图从左到右的5条扩增曲线，它们的起始模板DNA的量逐渐减少4.标准曲线的绘制要想绘制标准品曲线，首先要先制得标准品，得到标准品的浓度，再通过荧光扩 增曲线图得到标准品的Ct值。然后在以标准品的Ct值为纵坐标，起始拷贝数的 对数为横坐标绘图，得到标准曲线。标准品是自己制备的，所以浓度已知，用标准品去进行PCR扩增在电脑上会出现 一荧光扩增曲线，荧光扩增曲线的横坐标是Ct值，纵坐标是荧光信号的积累量， 不同浓度的标准品可根据图读出它的Ct值，比如下图中绿色的线是标准品的话， Ct值就是和荧光阈值交点所对应的横坐标，由此可以根据标准品的Ct值和浓度 做出一条标准曲线（并计算出标准曲线的方程）。然后用一未知起始模板量的样 品进行同等条件下的PCR，当电脑软件将荧光扩增曲线完全给出后，读出不同曲 线对应的Ct值，并将Ct值带入到标准曲线（通过标准品得到的标准曲线）上， 即可计算出它的起始模板量。明来程J cttCycle精环«)