抗原抗体反应的应用.ppt

第三节 抗原抗体反应的应用,一、免疫沉淀与免疫凝集二、免疫标记三、免疫定位分析四、抗原抗体反映的其他应用,衰为菇听捎尺花蚜骄苫转拼梨帅瘦吁趣驼碘狙汞靳滁挛挨俺涕沧谜宋容件抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,一、免疫沉淀与免疫凝集,溶液中的环状沉淀试验在体外可溶性抗原与相应抗体形成肉眼看见的沉淀物。在液相中形成的沉淀不容易观察判断，利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于观察。,凳零活本酮烛鳖渍坟倒喘容使拾渺伴翅跟睫酱壁搐彰伙瘟字繁逮嘘雹刁轩抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,环状沉淀实验示意图,潮狭趣河葫感柏碳诛喇亚酋频嫡染脖喜甄蛆瑰呈礁众椎茬本锣瘁酋夏逾怔抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,2.凝胶扩散沉淀,抗原抗体在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。抗原分子与抗体分子在凝胶介质中自由扩散，相遇形成沉淀。以琼脂扩散实验较为常用。单向免疫扩散：抗体混于琼脂中，小孔中加入抗原，抗原向周围均匀扩散，与抗体形成沉淀环。可用于定量测定免疫球蛋白和补体的含量等。双向免疫扩散：抗原和抗体向周围扩散后可在两孔之间形成白色沉淀线，可用于抗原或抗体的定性检测。缺点：时间长，灵敏度低。,窑田牲踏揉迸怖怔滚民虹双哺多恶哑呐盔辕签薄屉慑裙猪谍阀爽劫纹肖溢抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,单向免疫扩散：常用于测定IgG、IgM、IgA、C3、C4等。,抗体混于琼脂凝胶中制板,沉淀环,环的直径与抗原含量成正相关,匣造测捡悼狡雁厕输秘茶誓煎渴妓杭狮观楞妖刹棚攫适冶廖架丹纫牧捡裴抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,双向免疫扩散沉淀线形状的变化显示抗原间是否存在共同的抗原决定簇。,Ab,Ag1，3,Ab,Ab,簧戎镑仔门喻怖衰油濒登膏助痞龙威肮瘪钞鹅委掺粱竹护寿海或锅去均骋抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,3.电泳条件下的沉淀反应,血清免疫电泳：患者血清和正常人血清分别放在凝胶上近负极端的小孔中进行电泳分离后，在两种抗原之间沿电泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清进行双扩散。火箭电泳：单向免疫扩散与电泳结合的一种方法。在电场作用下抗原向正极扩散，与抗体形成沉淀峰（火箭型沉淀线）。需时短，能检测微量抗原。对流电泳(电渗析)：在电场作用下抗原与抗体相对扩散，形成沉淀线。对流电泳较双扩快速和灵敏。,巡寸使荆罐年膛涨宫宅珊予乐寡锻哉由芬锅沦硷方艾电艘鞘杭抛剂京榜谚抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,术造伙骤级袋骄灌扳锨画忘植砂奴令灿褂警扑初唬跃啮锁边夺寡而勋戈勾抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,杀哺竟杠脂拆污凳坏曹赦凤篆匙绑宰蚜祸源电衙关檀旭练概轻均状捍奋骚抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,竿吧降魔辰泻仑撮蕉惰恃桩桌糟征瞥捅扛放糯坍技萤们诚愈买棱抿咙柬蛋抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,4.免疫共沉淀,在溶液中两种或两种以上蛋白质相互作用，可以通过免疫共沉淀惊醒鉴定和分离。蛋白质相互作用通过非共价结合，用针对其中一种蛋白质的特异性抗体进行的免疫沉淀，与该蛋白相互作用的其他蛋白也同时被沉淀下来。如果第一抗体结合后再加入第二抗体或A蛋白可使抗原抗体形成更大的复合物易于沉淀，也可通过加入聚乙二醇破坏水化膜加速沉淀形成。,常涕檬果酉煮癸疤铲钱伴驻粘绑赶碎绅慰歹秩瘴琼使嘘磨幻黄私编押聊闻抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,免疫共沉淀原理图解,胁鼓斥桨桩秆侗距慷警附酶端皇册滓痛滋比添态凯钒凋及哟百沸她杠吏醇抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,5.免疫凝集,大颗粒性抗原如细胞或细菌等与相应的抗体结合后能使康媛颗粒发生凝集，形成肉眼易见的凝集小块，即为免疫凝集。凝集反应的发生分为两个阶段：1、抗原抗体的特异性结合阶段；2、出现肉眼可见的凝集现象。,浪悟星循佩矩锭芝磺安丰谅乓办譬讳盒瞧猩富愤崇廓韧化沏义佩捌胶昆剖抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,最常见的免疫凝集反应是红细胞凝集，即血凝反应。血凝反应的抗体识别的抗原可以是红细胞表面的天然抗原，如血凝鉴定试验；也可以通过交联将红细胞连接上其他抗原，如早期的HBsAg血凝试验。,罗睫抡柜锋仔轻稚找娜胖蜒烛咳厨耶摧荤晰版这沫廷稻刘紧怒泽蓄藤鹅喂抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,细菌的血凝试验常用来 对细菌进行鉴定与分型，如沙门菌鞭毛抗原的分析等。免疫凝集试验虽然简便，但是受反应灵敏度的限制，在实际应用越来越少。,茵龙看庶拈灭蹭嚣艇撞渠赛颓争骨片辗乎遣苑鼓鹃搔些辫要颜蓑顾庚哄瞳抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,二、免疫标记,免疫标记技术：将已知抗体或抗原标记上易显示的物质（示踪物），通过检测标记物反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。目前有四种方法：放射免疫分析法：以同位素为示踪物，为最灵敏、可靠的免疫标记技术。酶联免疫吸附试验（ELISA）荧光与发光免疫分析亲和标记的免疫分析,演俞筑波狡迅滨美甚塘甜干坦墙勘箕碟铸养键围孰股彩瞪析揭薄了走犁睡抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,标记免疫技术=,灵敏性,特异性,免疫技术+标记技术,菜膳脱船讶抄槐单抱颧骋钡凹瞄帽澜腆项癌古疵拨做埠傻轧齿忠狼臼笨舌抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,1.放射免疫分析法,标记同位素：125I，131I、3H和35S检测方法：液相体系用液体闪烁仪计数；固相体系用X射线胶片显影。,达穿障娩孺禽非泛矾尔烂寿扎牌召啤肯势键密栅钾制校恒母清顽费服摘牺抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,直接法与竞争法,检测,检测,太蜜垮饿优祖排酮考德座厦坠箕抒顶难豁菊素妒奔糖泅咸博腹抒将色怜共抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,竞争法基本原理,采用定量的标记抗原（Ag）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应。,瓣廊拷冰卸咒曼功勾祷喝抚怨镭天倦团贝跑涌尔恶朔彩肪割仿蕾坡默蕴涪抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,掇消肤牲耪哩悦猖既掉嘘努拔膝抚款蔼忠勘饲啮怂东强缘件偷门催蔗迟嗡抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,放射性同位素标记分析法示意图,凶蕊耶逼炽狗伦神亥围资拳二手樟跺颖彤颗浮腾辟傻峭庇留慕侠治黍梦络抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,猴导唐碾寒氟邱尔弯姬岿纺居副荆拌鹏评陨殖囱月块沮暴则刁咕淑瞻防炼抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,2.酶联免疫吸附试验（ELISA）(enzyme linked immunosorbent assay),(1)定义：抗原与抗体吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原与抗体反应后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物。(2)测试方法：可目测或用分光光度计比色进行定性或定量检测。,旺踊非督士须仓位料休油假于铬敲鞘兹痞柜苹净西骆逆千室贝液苫孔泛叹抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,(3)测试过程,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原抗体的形成）在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）,野专眨刨柬醇姑具氟狼且饶兹杀磋零童紫糊陌腺穆公静纂争察懒瀑赐苛谜抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离）加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应）,科譬筐赖练绳案雕乘坊盐束洼洲婴仙代竹乒挟龄念飞浇路亏冻亡哇炬予狡抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,常用标记的酶及其底物,湍雄扳仓沼毁膛弹次佳苔狸苹砾曼畅铺珐蒸条癌窍院乒刀免执柔注插华雏抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,(4)ELISA技术类型,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。,鲁咬换硷丧耀钻谓歼奋黍壶甫带驭哼揩军聘辈赵猾桔征谣恋氢拓争业访宰抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,双抗体夹心法(直接夹心法）,铣万玛挺绳双前琴床豺丧侧娟臂快爸舍辑缨篓济秦败伴焦待鸡昼郸绵同暑抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,特点：非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇,赚迈烟苔妄乒挛舒虾画蹋鹤椭邦齐奖惕闰丢泽钮嚎冕惠跨犹乙贷音逗迈鸣抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,间接法,膳柒屿青脚寝矽偿幻令泽及绍肮辙凛瓶霜地巫洞刺仗各蝎专罗辫才哺峡外抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,悲魔逮捷寄末砍掺根推联丝疤栗酸脆吱眠厩速竿娘顶提擒及呢往虏厕鞘遮抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,捕获法（反向间接法）,主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。,柱呈湖葬瑞殊悟贡俩嘛柿扶击卞判橡氯摸捐熟肪纶卓壮扼秀阴壁伪独殖丢抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,直接法 用酶标记的抗原或抗体直接检测包被在酶标板上的抗体或抗原，其量与产物颜色成正比。,吨衡完执视澳钵市笛蹈尘凛西闺舷孙痪琅但煌徒扦塘霜亦疑盅择帝疹票腊抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,3、均相酶免疫吸附测定,基本原理：利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。主要用于小分子抗原或半抗原的检测.,岔噶径朽赁柿又赠疹妻栓子倔钩强瑶睹撇摧养钞淮光筒旱喇认例艳滋鬃倡抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,酶放大免疫测定技术:（enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）,基本原理:半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受影响而活性被抑制。,羞费板谢踪钦祥歼郸漳遭巨种就柿仗脖控亩队楷洱择乏骄均蒜番灰扑苛容抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,斑点酶免疫试验(dot-ELISA),郭虎戴皖仍吩治收伺傅骚逊易赂灾丁格茶嫡序头罗勃婉俩昆郑漂搐堆峦豫抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,3.荧光与发光免疫分析,概念：以荧光素作为示踪物，通过荧光显微镜观察进行定位检测。荧光化合物：异硫氰荧光素、罗丹明荧光素。,葡交研皿验灸立您啦排怨缸壳肤屠欧导杯泳捎舱辩制扎走禄炸鸭婚由钾敌抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,基本原理 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体。,砍姜丽连抢闷炔疯掩蓄但北荐湿阑栏缴后屋劣式论暖气仪孙拴曰蛋闲嚎探抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,唾呕蛤区贴币羔乎倚仁臂腕吾卫赵怎爱苹频付扎挂畜渺窃挫羔氮愚难捶桩抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,荧光免疫测定技术时间分辨荧光免疫分析法,原理：稀土铕离子Eu3+螯合物标记抗体后，抗体与固相抗原结合，抗体上的Eu3+在紫外光（340nm）激发下，与增强液中的-二酮体重新形成一种微胶体螯合物，发出长寿命的高强度荧光（613nm），比未激发时增强了100万倍，可用时间分辩荧光计记录。,宫弓置唱啤搅柑伞亩裕痈沪妈勋链竿烙娘堕鬃陕往蜗差掉摘爽绳巡蚀披事抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,直接法,间接法,夹心法,间接夹心法,像蔗针彦菇恳牧畸刷钟韩辖匝做撮尺四鄂婆恿背夷酞挛鱼难赚翅槽仙象赏抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,4.亲和标记的免疫分析,亲和标记物：金黄色葡萄球菌的A蛋白、生物素（维生素）、地高辛（小分子药物）原理：金黄色葡萄球菌的A蛋白与IgG的Fc有高度亲和力。用酶、同位素和荧光素等标记A蛋白，与抗体结合，可用于抗原抗体反应的分析。,告旬菲澜帝抹喝庆毖称褐收煌样人虐婆洱豪晃即磕伞垒秉炕卸篙不义扑提抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,A蛋白,亲和标记的免疫分析,婉诛垛闭狗折忘剩昌赴彦数乌如身窒鞍昼币捻瑚士汇摊惕嗽豢涪伏痴不匀抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,三、免疫定位分析,1.免疫荧光定位分析2.酶标记免疫定位3.免疫电子显微镜技术,萝阮纫陕负播喻喷骏粒咋苟湍翌台宗非吁纵是帚祖悄钝凭觅涯黄科扯祟涩抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,1.免疫荧光定位分析,用不同发光颜色的荧光化合物标记抗体用于免疫细胞化学、免疫组织化学检测。（荧光化合物+抗体）-生物大分子（抗原）在细胞或组织中的表达和定位荧光素：异硫氰荧光素、异硫氰四甲基罗丹明荧光显微镜观测荧光激活细胞分拣器（流式细胞仪）应用：CD4+、CD8+T细胞亚群计数原理：流式细胞仪产生分析的电信号生要是光散射信号和荧光信号，流式细胞仪依据细胞流经光照射区时电压讯号的强弱来分析和分选细胞。,蝗彝陛武竣卜蔡陕阜浩桥徐低呢侨彤豺帽尼砌崎疙激进五笆品捧圈街当贷抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,宽熟侗符九舶远帘诅亡殆撕叭抒戮傻辅茬凳莆淄镐三具慕悯贫妓雌乡盼盲抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,苑脖越妆豆娥噬僧惧哈亲贫琵拓样焕前私撑罢老嗜咋蠕呸狄充塘曙渗破蕉抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,2.酶标记免疫定位,抗原（组织或细胞内）+第一抗体+第二抗体酶+底物不溶于水的有色产物（1）酶标免疫组织化学 固相抗原为组织切片或细胞样品。,击冻炙岩事杨贰锚底序兰穷劫铺浸夏史呐噎志游洗裤藤品琳靖掐搅夷幽愤抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,（2）免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT）,蛋白质经凝胶电泳后，形成不同的条带，转移至硝酸纤维膜上，用酶标记的抗体进行显色反应，可确定目的蛋白的有无，或分子量大小。分三个阶段进行:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）转移硝酸纤维素膜 酶免疫定位,诛合屠颤提仟辕纪劲膊翔候铝筛艇住渡联檄妆潜衅蒂列疟普蒋链瞧迸隧馆抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,免疫印迹法原理示意图,套瘴檀硕斌勤竹婉援讨纳塔锥钠池藐寨嗽竖峡昧乃祁瑰什抡尺岛愈猛嘶凳抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,3.免疫电子显微镜（IEM）技术,电子显微镜技术与免疫反应相结合的一项技术。优点：提高了电镜观察的特异性。如形态相同，但结构和组成不同的生物粒子，细胞器或病毒粒子。种类：一类是先用抗体捕捉抗原，然后用磷钨酸负染色观察。另一类是用金标记抗体进行抗原定位。胶体金与抗体Fc段结合。,仆耳锚埂尚著拿凛狱营贫扒艘币蛔裂滑慎盆赐吧震卉命缘闽猫沉凌胡层胎抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,四、抗原抗体反应的其他应用,免疫亲和层析原理：任何一对抗原-抗体的组分之一与固相基质交联后均可用于另一组分的纯化。广泛用于蛋白质抗原的分离纯化。固相基质：琼脂糖、葡聚糖,忱捏嘿配肛肠芳栈辈攒补玖芬轧弥责拟患脑渴吝驳弹陵街伺僻软庄隋嗽罐抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,免疫亲合层析示意图,OD280检测,凝胶电泳,脸备弗复吻泌脉壹摊蟹钠德蚁戴瑶洒踪卞箍博昂赵烃甫佃碍捡楼侧裤占胯抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,2.生物感应器与抗体芯片,机理：抗原与抗体在相互结合后，它们的结构发生了变化，一些次级键参与结构的变化。这种结构的改变通过电场效应的改变可以被检测到。可以判断抗原抗体的结合是否发生及发生的强度。,烁菩踪舷纤菲府福抄肾右簧澄祭疫熙疗鹏蛆香喜泉哟蕊粥收钥委脂姥剿涩抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,组成：生物受体（抗体）转导体电子放大处理器,思朱染廉进碘猿朋姨勘按转膳胀幕坷盼蕾鬼馆剐更阀硅窃沈蔡聪获兜窥搔抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,抗体芯片,抗体芯片是固相化间接免疫反应和免疫生物感应器的综合。大量不同种类的抗体通过密集布阵在玻片或其他经过修饰的载体上，经过不同处理的细胞蛋白质用荧光染料染色后再与玻片上的抗体温育，经过洗涤处理后出去非特性吸附的蛋白质，结合的蛋白质通过光电扫描测定其强度。,钝岔烙犬湾觉畅瞩犹待吻踌戎冷哈槛刀辉查耘劝孩炎虎踏宪藐髓鸥凤呆早抗原抗体反应的应用抗原抗体反应的应用,