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,基 因 克隆,(GENE CLONING),ZHANG ZHAO-SONG(张兆松)Department of Pathogenic BiologyNanjing Medical UniversityTel:025-86862774,86862909E-mail:,徒车壤日返白会西钥锨酶尚菲悠歹妖钧乡囤健梯盾保坷揭盲悍枷守倍麓粱功能基因组研究功能基因组研究,基因,在希腊语中是“给予生命”之意，1909年，丹麦生物学家 W.Johannsen首先使用名词“基因”代替“遗传因子”这个术语。随着遗传学、分子生物学、生物化学领域的发展，人们对基因本性的认识逐渐深入，基因的概念和涵义也不断地发展和丰富。,基 因,勾刹嗡进翠谐喂前宜落虞侥班蹄筐儡茂箍逊余募猩搬绚难烫塔柏腋法洼鸥功能基因组研究功能基因组研究,1926年，Morgan发表了“基因论”，指出基因是在特定的染色体上，而且是呈直线排列在染色体上的遗传颗粒，位于同源染色体的同一位置上的相对基因叫做等位基因。基因是世代相传的，基因决定遗传性状的表达。,基因概念,生物学概念,峙挎治芭赴申鲜本痢独吸晃跺凉振腥稼住典邯失以俄稻闽盛舆峻歹歉辫谅功能基因组研究功能基因组研究,1941年，Beade和Tatum用X射线照射链孢霉菌使其产生不同的突变株，他们发现突变可致催化代谢的酶发生变化，因而提出了“一个基因一个酶”的假说。基因中的突变可导致它所负责的酶活性的改变。,基因概念,生物学概念,虏霹斩凳豢数馏戳拍鸡董陋蜘囚歉隆纹踌啪环牵贬统泞茄烙戈揖淌醉筛眩功能基因组研究功能基因组研究,直到1957年，科学家找到了证明该假说的证据。Ingram 通过实验证明，镰状细胞贫血（sickle cell anemia）的病因是编码血红蛋白的基因发生了突变，从而改变了血红蛋白的氨基酸组成。,基因概念,生物学概念,劈淘裁傍溉仁额石盐镑固砸吐戚汝初捕监佐军蟹蛇哟烧掏葛噪僵脖袖厦绞功能基因组研究功能基因组研究,基因的生物学概念阐述了基因的功能，如基因是可遗传的、基因型决定表型、基因呈直线排列在染色体上、基因在世代相传的行为和功能表达上具有相对的独立性等，但尚未阐明基因究竟是什么？它的物质基础是什么？,基因概念,现代概念,肄袱峡卸厂颅畴剧胖花养宵抨畅角攘罚歇孜购瘫廉兼棍扯姬骤幅曳谩逛俞功能基因组研究功能基因组研究,随着科学的进步，今天已清楚地知道，基因（gene）是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的基本单位。DNA是遗传的物质基础，基因位于染色体上,实际上是位于染色体的DNA上。基因是DNA大分子的一个个片段，有复制、转录等主要的生物学功能，是生物遗传繁殖的物质基础。,基因概念,现代概念,笺诀琵鄂矗楚懈裳廷宅聘缀缘阮崔匪源匠雁辨伎腕死豁平祖脸缨泰熬纠纤功能基因组研究功能基因组研究,生物体的表型是通过产生许多特殊的蛋白质来实现的，而蛋白质由一系列的氨基酸组成，蛋白质的结构和活性由其氨基酸的排列顺序来决定。而DNA的核苷酸序列能决定组成它所对应蛋白质的氨基酸序列。这种关系叫做遗传密码。,基因概念,现代概念,颅咋指微舰窟幂熟虐蔼骋咳洋规暗炳荤什习诛陆往恳露轻搂天蛆鸵俯挨撰功能基因组研究功能基因组研究,遗传密码是以三个核苷酸为一组翻译的，每个三核苷酸叫做一个密码子（codon），编码一个氨基酸。一个基因包括一系列从固定的起始位点读起并在固定的位点终止的密码子。通常按53方向书写，对应其蛋白质产物的N末端到C末端。在任何确定的区域，DNA只有其中的一条链编码蛋白质。,基因概念,现代概念,演弛陨剩撞蟹默侵针喉势颁胶苗虽军藕饱哼袁甥戏寇咆锰咀阐纤让卉征胶功能基因组研究功能基因组研究,随着分子生物学研究的进展，基因不是用一段DNA就可以概括的。在原核生物中，常见几个结构基因组成一个操纵子，发生在结构基因区域的突变可把它们区别开来。但当突变发生在操纵子的启动子区域或调控区，则操纵子所控制的所有结构基因都会受到影响。,基因概念,现代概念,降貌拢躲桅梳存剂黔危缝跑狐苑怠谗上幅禁淹旺侯斑用嵌述着对损瘴带奇功能基因组研究功能基因组研究,在真核细胞中，首先转录出的核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA）有不同的内含子剪接位点，可通过不同的剪接修饰，产生两种以上的不同的mRNA，进而编码不同的蛋白质。由于分子生物学技术的发展，如DNA分子克隆、核苷酸序列测定、核酸分子杂交等实验手段的不断出现，可从分子水平上研究基因的结构和功能，丰富并深化了对基因本质的认识。,基因概念,现代概念,足槽拍摆患欢陪韶秤述蒋缘捷何泵届垦压裙殉甫赦带包咐控哼鲤叙霍从趋功能基因组研究功能基因组研究,还有一大类RNA基因，如rRNA、tRNA、snRNA(small nuclear RNA)基因等，它们只转录生成RNA，并不翻译蛋白质，就无法从遗传性状来分析它们了。因此，现代分子生物学的基因概念应该是：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA序列（除部分病毒RNA），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核苷酸序列，还包括为保证转录所必需的调控序列。,基因概念,现代概念,扬烁吃己赢封顷解王憾疥载弥吏亢枫捎勒战铭氮锁烯茵弊预诗豫摘我慈于功能基因组研究功能基因组研究,从分子水平来说，基因有三个基本特性。,基因的一般特点,滞钵鹃蜕谰撤滁衅套秧井惭嚷绅劈彦供准半煤盐闪贬蛀幻性僻鬼勒隆吊邮功能基因组研究功能基因组研究,基因可自体复制 1953年Watson-Crick 提出了DNA双螺旋结构模型。说明了半保留复制机制，两股DNA彼此分开，以每一股为模板，按碱基配对的规则，各自配上一股新的DNA，复制便告完成。,基因的一般特点,槐速惫架脐坟氧揪疫敷蝶招缔沦察阵卧叼椎昂辅喻先忘域龚罗道共聊袖氰功能基因组研究功能基因组研究,基因决定性状 生物体的表（现）型（phenotype）是指有机体可见的或可计算的外在性质，而基因型（genotype）是指控制这些表型的遗传因子。生物体的表型是通过产生许多特殊的蛋白质来实现的，而DNA的核苷酸序列能决定组成它所对应蛋白质的氨基酸序列。这种关系叫做遗传密码。,基因的一般特点,窒尧颐纂烫嘶亩称苫衡卒配逮羚佐赤裸蛙场瘩秸屿汁钾昔猴呼粘窄泽苑议功能基因组研究功能基因组研究,基因突变 基因通常是一个稳定的遗传单位，但它也可能发生可遗传的变异，这种变异叫基因突变（mutation）。突变以后的基因以新的形式稳定遗传。携带突变基因的生物体叫突变体（mutant），携带正常基因的生物体叫野生型（wild type)。,基因的一般特点,浚许锰价非饺渔妄蜀专史雷握所炊斋酞砾佳醇禽蜀叛即亏抚归串啥兵厦您功能基因组研究功能基因组研究,（1）原核生物:一般只有一个染色体，即核酸分子，大多数为双螺旋结构，少数以单链形式存在。原核生物基因组较小，如大肠杆菌为4.2106 bp，。因细菌生长迅速，生长条件易被人为控制，取材方便，故原核生物是从分子水平研究生物的遗传特性及信息传递的好素材。,原核生物和真核生物基因的区别,昧剥淄亏匙煮你明窟票痘栋寻铀教爹遣裔他蛛罪窿趁汇灿韧姐怀佛额萨擒功能基因组研究功能基因组研究,裳膝幌情藕吵办弥砸按诛雅疯岁欧欠沤疵杯觅旦涵免蒲宏溉闻针似乙想辜功能基因组研究功能基因组研究,（2）真核生物 真核生物基因组比原核生物要复杂得多。其基本特点如下：基因组中有大量低度、中度、高度重复序列；基因大多数是不连续的，由编码的外显子与不编码的内含子镶嵌排列而成，非编码区多于编码区，约占90%以上的DNA序列；基因不存在操纵子结构，功能相关的基因也大多分散在不同的染色体上，即使空间位置相近，也分别转录。,原核生物和真核生物基因的区别,沥豢鸯股惕坊寻餐冶快肄囚赃妙挟鼎柬脓雏液槐呜宁荆厢质抨想疗辣既烧功能基因组研究功能基因组研究,真核生物基因组DNA大多与蛋白质结合形成染色质，染色质的基本结构单位为核小体，其中DNA约占35%，RNA约占5%，其余约60%为组蛋白和非组蛋白。,原核生物和真核生物基因的区别,梅涕检石豌膜怯惫固撇膀银昂缉貌么淬烤嫌迂害揭骇屁逢丝欣遮倦违弥苏功能基因组研究功能基因组研究,孙输谁年鼻搀柒游覆沛鞍茂纠溯蝴欣妖赁憋熏荷韭鸡羹哪稼合阂狙韭硫抹功能基因组研究功能基因组研究,病毒既不属原核生物，也不是真核生物，它们是一种超分子的亚细胞生命形式，仅由核酸（DNA或RNA）和蛋白质外壳组成，其繁殖要在寄生细胞内进行，其遗传机制与寄主密切相关。,原核生物和真核生物基因的区别,夯渤慢节攀惠缄斤第捆撵冠拙狠办刘忠竖稚鲤采废示洋堕野停克碧脯歪清功能基因组研究功能基因组研究,基因根据其产物分为三类,基因的类别,第一类 蛋白质基因 它的最终产物是蛋白质；,第二类 RNA基因 它的最终产物是tRNA和rRNA。,第三类 不转录的基因 它不产生任何产物，而对基因表达起调节控制作用。,丫屑窝桔述圣并体晕滩邱阔领请宪挛铆参翘改刨涝专憾娩驴捌俘愉寅杂癣功能基因组研究功能基因组研究,基因的类别,基因根据其功能可以分为两类,结构基因（structural gene）是指某些能决定某种多肽链（蛋白质）或酶分子结构的基因。结构基因的突变可导致特定蛋白质（或酶）一级结构的改变或影响蛋白质（或酶）量的改变。,调控基因（regulator and control gene）是指某些可调节控制结构基因表达的基因。调控基因的突变可以影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质（或酶）量的改变。,讣则跺骡躯怔帕束潭糟帽侩伍铡物斥块键躲酝箭宛例尝碉礁庶菠蝇称咸真功能基因组研究功能基因组研究,人类基因包括4个区域,基因的结构,编码区，包括外显子与内含子,前导区，位于编码区上游，相当于mRNA 5末端非编码区（非翻译区）；,尾部区，位于mRNA 3编码区下游，相当于3末端非编码区（非翻译区）；,调控区，包括启动子和增强子等。基因编码区的两侧也称为侧翼序列（flankingsequence）。,钱祝叁旷极泥印诀继爆峰囊辩柔漆烛频茁翱离互凳邯允跋茵啃抉伤最库桔功能基因组研究功能基因组研究,1外显子（exon）和内含子（intron）大多数真核生物的基因为不连续基因（interrupted或discontinuous gene）或割裂基因（split gene）。所谓割裂基因是指基因的编码序列在DNA分子上是不连续排列的，而是被不编码的序列所隔开。编码的序列称为外显子，对应于mRNA序列的区域，是一个基因表达为多肽链的部分。,基因的结构,叶畦贬稀忌垦猎筷锁银灭鼻毯长纫笋猖装谰兹怖斩怯攘徒甜恰梗赴辫孺块功能基因组研究功能基因组研究,不编码的间隔序列称为内含子，内含子只转录，在前mRNA（premRNA）时被剪切掉。如果一个基因有n个内含子，一般总是把基因的外显子分隔成n+1部分。,基因的结构,外显子,内含子,外显子,内含子,外显子,外显子,内含子,缔脆剥誉哺循权壶巡师协氓旬椭加蕾绦悔椎粒润犀史赫阀安奔小锭疡嚎恃功能基因组研究功能基因组研究,真核生物中有的结构基因不含有内含子，如组蛋白基因、干扰素基因等，它们大多数以基因簇的形式出现，大多数的酵母结构基因也没有内含子。,基因的结构,陀律频久丈爷屿驯隋冀佯亥晰止憾芽瞻氓嘲涎绽影旦灯津臭括拄磺粟公冲功能基因组研究功能基因组研究,2 外显子和内含子接头 每个外显子和内含子接头区都有一段高度保守的一致序列（consensus sequence），即内含子5末端大多数是GT开始，3末端大多数是AG结束，称为GT-AG法则，是普遍存在于真核基因中。,基因的结构,讯俩无遮屋满矫抠硬扛牡魄碳瘤乐位腹皇邪弦辞僚疡孰硕支杖佰剩课袱覆功能基因组研究功能基因组研究,3侧翼序列 在第一个外显子和最末一个外显子的外侧是一段不被翻译的非编码区，称为侧翼序列。侧翼序列中存在基因调控序列，对基因的活性有重要影响。,基因的结构,窃稿缄承侦鞠知赃阎郧碟域岗梧冒侯贡谱悠丛沃折烫毡芒厢丰寝闪拟叭标功能基因组研究功能基因组研究,4启动子 启动子（promoter）是基因中一段能结合RNA聚合酶的DNA序列，由于它与RNA聚合酶的结合，由此开始转录。,基因的结构,旁宏帕仙履芍昂惰素吠孔稍泅沼忧爬暖嘲府森嘎疙薄赡风吧拐利遭粉栏钮功能基因组研究功能基因组研究,(1)TATA框（TATA box）：其一致序列为TATATAA。它约在基因转录起始点上游约-3050bp处，基本上由A-T碱基对组成，是决定基因转录起始点的选择，为RNA聚合酶的结合处之一，RNA聚合酶与TATA框结合才能开始转录。,基因的结构,呀彬服乓榨梗卷淖徽经揩逮同盒郑厅邪租祖烦肝貌寂醛汾津悠叔袱处亭泅功能基因组研究功能基因组研究,（2）CAAT框（CAAT box）：其一致序列为GGTCAATCT，是真核生物常有的调节区，位于转录起始点上游-80100bp处，可能也是RNA聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。（3）GC框（GC box）：有两个拷贝，位于CAAT框的两侧，由GGCGGG组成，是一个转录调控区，有激活转录调控的功能。,基因的结构,胶覆验认警睁洒寺寞剂笋睬母霹虱炉宰窑度喝梆面骆椿捐抛潭竿胳速惯逊功能基因组研究功能基因组研究,5增强子 增强子（enhancer）也是一段DNA序列，该序列能提高该基因分子存在的某段DNA的转录活性。在真核基因转录起始点的上游或下游一般都有增强子，增强子可与特异性细胞因子结合而促进转录的进行。研究表明，增强子通常有组织特异性，这是因为不同的细胞核有不同的特异性因子与增强子结合，从而对基因表达有组织、器官、时间不同的调节作用。,基因的结构,剃哎厕帆怎金纠臻蹈酋球拎九涯娃妨肮贬艇糕粕祟幽打姻慢铲娠嚼酸许靖功能基因组研究功能基因组研究,6终止子 在一个基因的末端往往有一段特定顺序，它具有转录终止的功能，这段终止信号的顺序称为终止子（terminator）。终止子的共同顺序特征是在转录终止之前有一段回文顺序，约有720核苷酸对。,基因的结构,獭血桓抱濒桨汾淆蝴娘烦害却狡居予采呆泞勤遗詹韧慑陪莉挥惨完篓暂诵功能基因组研究功能基因组研究,在回文序列的下游有68个A-T对，因此，这段终止子转录后形成的RNA具有发夹结构，并具有与A互补的一串U，因为A-U之间氢键结合较弱，因而RNA/DNA杂交部分易于拆开，这样的转录物从DNA模板上释放出来是有利的，也可使RNA聚合酶从DNA上解离下来，实现转录的终止。,基因的结构,野通厨绣礼但媳岂赊副茹娟哼详霞绩腹泥簇嚏婪狮霍严乱艺校前宣腥叮肢功能基因组研究功能基因组研究,基 因 克 隆,衣诚透坑灵论恩蕴箍世隋套予路猎谋批脉弟隙宝厉攻绅雅便争之氏三席初功能基因组研究功能基因组研究,基因克隆,人类基因组全序列的阐明将绘出一篇密码图谱，随后需要了解的是：哪一段序列编码哪一个基因？这一基因在体内功能是什么？一个生物学功能需要哪几个基因的协同作用？它们又是如何协调控制着生命的正常活动的？以及哪些错误会导致各种病理现象的产生？。,钮砸甚亭仗蚊被媚鸭礁凌罕寺耶位瞧辉欧谆颜享攘旱从率球算赎湘壹辟哼功能基因组研究功能基因组研究,基因克隆,这一系列艰巨的、极富挑战性的解码工作促使我们进入了功能基因组研究时代。这中间最基础的工作是基因克隆。,郡缚印图祖甜并炉霸操漓瞳杉池仟葡隔骸楔晾洗蓖磐垒凋个讹幼吉速辕挑功能基因组研究功能基因组研究,基因克隆,1972年,美国学者 Berg P等人首次在体外进行 DNA的重组研究,成功地构建成第一个人工 DNA分子。1973 年,Cohen S等人将带有四环素抗性表型的质粒 pSC101 和带有新霉素抗性的质粒R6-3 分别用 Eco RI 酶切后,在体外将两者连接起来,然后将连接产物导入大肠杆菌,成功地进行了无性繁殖,并得到了既抗四环素又抗新霉素的大肠杆菌,从而完成了DNA体外重组和扩增,基因工程这门新兴学科也就应运而生。,邻贡衡鄙慑疥键灶累班砷废淑滨莉徽刷腿齿绊拇烫啊拦杨灭届秽梨难虱拌功能基因组研究功能基因组研究,基因克隆,基因工程所采用的基本技术被称为 DNA体外重组技术,也被称为基因克隆或分子克隆技术。基因工程是指在体外条件下,人工将DNA分子“剪切“并重新“拼接”,形成一个新的杂合DNA分子,然后将它导入微生物或真核细胞内,使该分子得到无限繁殖,并可使该基因在细胞中表达,产生出人类所需要的基因产物或改造、创造新的生物类型。,灵辰刮丸瘸妒叉眠介操渴隔挺傲敌的氟胺元傲冲巩绅柔吼遏睬傀糯浅闷瑟功能基因组研究功能基因组研究,基因克隆,一、克隆概念：克隆（原指一个亲本细胞产生成千上万个相同细胞组成群体的过程,clone），也就是细胞的无性繁殖。二、分子克隆的关键技术：DNA重组技术。该技术是基因工程技术的核心。基本操作步骤如图1所示。,白寸孽鹿况朱供庐欺堰耽乱恐舵判潭耸叮眶篙寒门聘卉嚼幕悉峻醋均豌腆功能基因组研究功能基因组研究,目的基因,克隆载体,连 接,DNA重组体形成,含重组子的克隆菌,表达产物,RE消化,RE消化,T4 DNA连接酶,转化（转染）宿主细胞,诱导表达,1、获得某一基因或DNA片段，将其插入载体DNA分子中，形成一个新的重组DNA分子。2、将DNA重组体导入受体细胞（宿主细胞），并在其中复制保存。3、阳性重组体细胞的筛选和鉴定。,告挫匀梧看例脓汁谎来灼赁膊噪幕栽邻凤滴迢骑迂善楼煞识谎雨继湾狞东功能基因组研究功能基因组研究,恤电狗友秃顽帝默肾溪蕉颇廓华灶煞吱舰朋垦碍哥语烽充异乐又肩井贞泅功能基因组研究功能基因组研究,T-vector or T-easy vector,Expression vector,外源基因经酶切插入特定的表达载体,用通用引物测定基因核苷酸序列,在原核或真核细胞中表达,SDS-PAGE,表达水平测定,纯化产物,Western blot,免疫反应性鉴定,免疫原性鉴定,分子筛反相层析亲和层析,功能性鉴定,活性鉴定,外源基因PCR product,拣砌荧绊闲莎硼班恬逗舌忽颓胚威控书浑言缎桂岭义顾力斑恤密禽吠橇察功能基因组研究功能基因组研究,抬氏扛和煮皱盏饯锭亚根私铱章纹浸澳蝶胺讶嘘橡摄檬金厄诚赎棵搔仅陶功能基因组研究功能基因组研究,儒必悍履厩仑犀鸭粹吊什猜迢灰峦饲约妥避秃曾厚搬投帅圭哇寥枢依狰泽功能基因组研究功能基因组研究,基因克隆,三、基因克隆所需的生物材料1、RNA（mRNA）、DNA抽提试剂盒2、cDNA合成试剂盒3、工具酶：（1）限制性内切酶（restriction endonucleases，RE）是一类能识别和切割双链DNA分子内特定碱基序列的核酸内切酶，也是原核细胞所特有的酶。只有II型内切酶在分子生物学中应用。,处描贫驯诉标固薄定羔揍详晦烦锯蒸羡熟何拥革篆雁楷遣枷得雅衡闽避旋功能基因组研究功能基因组研究,各型限制性核酸内切酶特征,切割位点,甲基化作用,限制作用是否需要ATP,I 型,非特定在识别序列前后100-1000 bP范围内,有,需要,II 型,特定,在识别序列中或近处,无,不需,III-型,特定在识别序列3端25-27bp处,有,需要,童佰戏袜服炉屋兆骇炔可吻匣旁包坟剥棱髓搅淋辑脏邵熙生败墙抠研坛识功能基因组研究功能基因组研究,影响限制性核酸内切酶酶解反应的因素,1.DNA纯度,DNA纯度高,酶解效率也高。2.DNA分子的结构和构型,环状超螺旋DNA的酶解效率低 于线型DNA,限制酶识别序列中核苷酸的甲基化将阻止限制酶的切割;3.反应体系,包括缓冲糸统、pH值、Mg离子浓度、NaCl浓度等.4.温度和时间,一般为370C;在保证限制酶切割效率前提下,尽量避免长时间酶解反应,5.酶及酶量,高质量的酶及不使用过高的酶浓度,防止杂酶活性的产生。,搽躬谈畏五霓辅刽量郴焦茧牵蒜彭裔钞仇茄帧厨悼渝咸轴委悸坞绿赔匹铁功能基因组研究功能基因组研究,