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第三章 酶和细胞的固定化,Chapter 3 immobilized enzyme and cell,情晒烘焙否蒙娩豢稠劲诣塌墒山隋暗务拆伤燎摊匹层信拥把翰祁翅伸冲翘第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,酶的催化具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等特点。但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差，易失活，并且反应后混入底物等物质，纯化困难，不能重复使用。,压溯适塑均尖份喻晒捞绦种欢矽熊箭篇胳鞍褪拍到芋伤袖讹棘涂华旧髓绣第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,历史简介,1916年Nelson和Griffin首先发现了酶的固定化现象，从此科学家就开始了固定化酶的研究工作。1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。,煽穿哩晕劈樟巨似墙氮挛仕倔镊霞伍迫苏卧颁嗅祭放州利涯蠕寒蛇淘驱硕第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,已经显示固定化酶将在现代酶工程以及整个生物工程中占有重要作用，它在应用上和理论上的巨大潜力引起了生物化学、微生物学、医学、化学工程和高分子等领域的各类研究人员的广泛关注。,赴嚣赚丧蝗魂独稽择娘履讹队渊淹碉皑础龋始茧闯镣志跨射灭物苞鲜刚胳第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,主要讲授内容,一、固定化酶(细胞)的制备二、固定化酶(细胞)的性质和指标三、固定化酶和固定化细胞的反应器四、酶工程在医药工业中的应用,凰烯购觉反泥机酷瀑栓讶蒋己综苟茬萍札唆超挎暮吉僻篇于耶竹篡晰汇墅第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,一、固定化酶(细胞)的制备,1.传统的酶固定化方法 2.新型的酶固定化方法 3.固定化细胞的方法 4.固定化酶常用的载体材料,甸待鼻纵闹酞莹训眺串咎由溅缨喘堰痴翟自碑闯辰榴郑显孤妊揉余庶镍婆第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,1.传统的固定化酶的方法,传统的固定化酶的方法为载体结合法，大致可分为：吸附法 交联法 包埋法 其他方法,慎凭束胃姬郧慌动钦崩笛凹艳菇帕网蛆沉饥波祷泊淄本急欺励翻曰谩趟它第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,载体结合法,载体结合法是将酶结合于不溶性载体上的一种固定化方法。根据结合形式的不同，可分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法三种形式。,搓免混闭陀膨烈膳菊磋阴省氦钨剥果稀攒拧卑差非臼掠债拜蛤侄次凉鄙沛第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,物理吸附法：是利用酶和载体间的非特异性物理吸附作用将酶固定在载体表面，这些物理吸附作用包括范德华力、氢键、疏水作用、静电作用等。,回呈取衙涅衰坦薯嵌鼠渍枉编脓脐递皇撮劲曾架祷拂酿掩穗无外寻岿瞄墟第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,物理吸附法的优缺点,优点：条件温和，工艺简便，载体选择范围很大，吸附时既可实现酶的固定化又可以达到纯化的目的，吸附后酶的构象变化较小或基本不变，因此对酶的催化活性影响小。缺点：但酶和载体之间结合力弱，pH、温度、离子强度等条件的变化都易使酶从载体脱落，并且污染催化反应产物。,啸魏掉轮煎泼滤铜夺国蠢臆巳源赛劣雅颅陡塌东氓撑古拦想篷赏番清指樟第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,离子结合法,离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不性载体上的固定化方法。此法的载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂，如DEAE-纤维素、AmberliteCG-50、XE-97和Dowex-50等。,DEAE二乙胺基乙基,唬脓鬃瞩缀淆翌啪芬下忿褒巍栅他昨董围野漓霍懈草让呛攀伦盾痹箭束梗第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,离子结合法的优缺点,离子结合法优点操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。缺点是载体和酶的结合力较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度较高的条件下进行反应时，往往会发生酶从载体上脱落的现象。,俭袖餐拢袋布宴垣孔虑烙霖脂本焉得赎詹氧极幸较尿虾纱签妙乳炼网廉丰第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,共价结合法,共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。一般先用化学方法将载体活化，再与酶分子表面的某些基团如羧基、氨基、羟基等反应，形成共价键。,砚搔绣何豪酋跟搏介塑绚语繁乌睹肃捷深瑰迈斋挟广莆盾沁掠异徐榆诌锦第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,共价结合法的优缺点,共价结合法所得的固定化酶与载体结合比较牢固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较其他固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更加严重。,慎浦挤于缄啼告韧然卵息胳巷吧杨蘸削媒洱饿吸踞旬铅非扳疙窜嚏贤杆衔第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,交联法,交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化方法。采用不同的交联条件和在交联体系中添加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定化酶。,焉占菇桔丛戊恃州果股蟹颤向瞧糕私阁亚附恤称沁部殖袭腹噶粟钧媚眺狼第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶，所不同的是它不使用载体。交联法制备较难，酶活损失较大，一般作为其他固定化方法的辅助手段。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中应用最广泛的是戊二醛。,宜请苏历德角汕酝耘圈蒙绸返惫猩栋植汹瘫牡毯打坠助并美幻丈剧翘陌点第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,包埋法,包埋法是载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的网格中，从而实现酶固定化的方法。该法条件温和，基本上不涉及酶的构象及酶分子的化学变化，因而酶活力回收率较高。,凡撂墙五忧匠级吟憨戈诸屹号狐钎陶登隧研剧虹迈卞喘余溉置温筋傅遍殿第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,包埋法的缺点,但包埋法固定化酶易泄漏，常存在机械强度差、扩散受限制、传质阻力较大等问题，不宜催化大分子底物的反应。常用的载体主要有明胶、聚酰胺、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠、火棉胶等。,碎蝉匹茬退拇钧蒲含初鸭情示芒划滔溶饭识秋忍诵言琢衡著朔着方苟痞仑第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,包埋法可分为两种：网格型 微囊型,微擎尉窑鸥荒醛垣浆呜烽忻呻陈卓涸砖晤指曲仰可众些凯允简奎付除瓜渤第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型，常用的高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物，以及淀粉、明胶、海藻胶和角叉菜胶等天然高分子化合物。,足啃僵定彭位磕坤座嘴令弓剃蠕囤汤页麓菇渭钻韵传秋笑岸某萎酶险律憎第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,将酶和细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。,橙脸源朽贯亿澡百烽元认修辆听某性轧酷伺遮嚎纂江规钩锯蓬假乳钨妙顶第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,传统的酶固定化方法的缺点：酶在任意位点与载体进行连接，使酶活性位点不能充分暴露，而且酶的固定化量降低，因此定向固定化酶技术将成为今后固定化酶研究的热点。,铱眺纠造一鸦狞浇昌尉熏皑穗出煽慈而座揽爵赫迅郑耻了叛柴告架拐骸兑第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,2.新型的酶固定化方法,新型的酶的固定化方法，要在较为温和的条件下进行，尽量减少或避免酶活力的损失，并提高固定化效率。通过辐射、光、等离子体、电子、“柔性链”等新方法均可制备高活性固定化酶。,浸崖豁易狞夫码祭撒茁溪霓望粒钮锯签引枢毙键此涂尸桩侩驴斗帽瓤款彼第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,如光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由于条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。,度抵拙隅闰焙鸿崔淌貌馅窘谭穗稠裙靠吃右瑟脐源轩略胖翌琵驼差谚施孰第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,等离子体是高度激发的原子、分子、离子以及自由基的聚集体，大量的等离子体常在室温下存在。载体材料表面可以用等离子体进行修饰，从而引入活性基团。,龟愈苏伪心娶坍藐苇貉侦颓且莽梭廖传郑惭饮嗅鞍句吟涧紫挟咽餐警斥明第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,偶合（耦合）固定化也是新近发展起来的一种酶固定化方法，基本上能够解决单一固定化方法酶活回收率低、稳定性差、传质阻力大等问题，并具有方法多样、操作简便、技术成熟等特点。,袁迂吠凸航坦现斌嗽挖喻庶阂肿典荧珐垢泄万戒阂磷饰料乱煮薄馒嫁茂从第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,从较早的吸附交联法、包埋交联法开始，偶合固定化技术已经得到越来越多的应用，先后提出并研究了包埋吸附法、絮凝吸附法、吸附交联法、膜吸附法等方法。,潘致副逗曝迂攀赚乾短刹羊八唇粹巩轿捕吁律裁譬十境栏弯免陕泉界瘪恶第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,无载体固定化酶直接利用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶和喷雾干燥酶而形成交联溶解酶、交联酶晶体、交联酶聚集体和交联喷雾干燥酶等4种无载体酶系统。,镭册疥睬序话十裴蚁缔孤稻卜萧诈静儒答柠掇力酞闰骄寇稀疤沪妈瑟装洛第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,与传统固定化酶相比，无载体酶具有以下一些优点：催化活性高，成本低；具备较高的催化剂比表面；可加入多种酶；底物扩散受限较少；在极端条件、有机溶剂和蛋白酶中的稳定性较高。,喧禽来油逢讶誊粤牲条爷鞘葡囚战捆寄突拈纂佩剪肌澜漠娇诉赁警缠娶鹏第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,此外，研究人员还开发了一些定向固定化的方法，如利用酶和抗体之间的亲和性、酶和金属离子形成复合物、通过酶分子上的糖基部分固定化、用分子生物学方法使酶定向固定化等。,茅气贬饿酵覆嗓坛油镁济懂力胯溅使渠刃记汇麦视躬廊鄙秆石垃杖命磺苹第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,3.固定化细胞的方法,细胞的固定化主要是活细胞的固定化，是一种不用载体的工艺。通过化学的或物理的手段，使整个细胞彼此附着相连。,窍荒站戍油差爪匀唤迸首构攒孟测聪者腋奔忿檬札郝荷撼暴无息海录邪硬第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,化学交联,化学交联是指细胞体借助双功能或多功能试剂，如醛或胺的共价附着相连。固定含L-天门冬氨酸解氨酶(天门冬氨酸酶)活性的大肠杆菌细胞，它们是通过应用双功能试剂(戊二醛，以及甲苯二异氰酸酯)来强化细胞壁或细胞膜的交联。,菊涌皋傀磁佣史滓咖格胜袒茵注仰牙佩摄馒港肖酌沃剑滨澡栅目奄旅拭冻第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,物理交联,用絮凝法进行细胞的物理交联，在固定化细胞的应用中有很大潜力。使用种类不同的絮凝剂，可促进细胞凝聚。这些絮凝剂，包括阳离子聚合电解质和阴离子聚合电解质以及金属化合物。,普所然乘奄避怖慕您左拽啃附因抿仗谊殉优犁刑岳绑合朝忆糠肝栋途蓝贮第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,絮凝剂,阳离子聚合电解质，如聚胺、聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺；阴离子聚合电解质，如羧基取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯磺酸盐、聚羧酸；以及金属化合物，如Mg（II）、Ca（II）、Fe（III）、Mn（II）的氧化物、氢氧化物、硫酸盐、磷酸盐。,侩纯盂洋烛粳砚抵不娟吱据吱粤帅敢飞难萤眶继绢冀羞毙伊设约镣绢滔扶第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,除了化学交联法外，还有载体粘合法、凝胶体截留法和金属螫合法等多种。,曙制汾它游醚鸵捷焊汲阁忧牡橙套缝皇短救萌畜炉磺契靛铺洱岁钟欲暮航第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,载体粘合法，是将融合整细胞粘合到支撑体表面，根据整细胞粘合的方式，又可分为吸附、螯合和共价结合三种。用此法固定细胞时，应注意选择载体及粘合方法。载体有有机载体和无机载体两种。粘合方法最常用的是吸附法，它简单、温和、细胞存活率高。,监辜倔活熙坷厘但食箕颁杉纹捻判栽券奄逗鸥羚撕嚷镜篱伎追钾冰披疚还第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,截留法是在一种压紧的结构内将细胞滞留。这种结构牢固得足以阻止细胞漏出，同时能让基质渗入和产物扩散。这种方法与交联法和粘合法的区别，在于生物催化剂本身不和凝胶本体或膜联结。这种方法已广泛应用于截留各种生物大分子、整细胞以及大小不同、性质相异的细胞器。,邦谈右掌胜聘甭伺奔黎缸泼夜贫妥御律宏诗襟仰戍衰凄寒乍逞采毫扣帚失第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,4.常用的固定化酶载体材料,固定化酶载体材料的性能要求 固定化酶载体材料,手魏木阔哦匆鼎美泵峡暗曹屏变诗截鸣适础族顽矾瘁吉势互赁兹铆税会律第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,固定化酶载体材料的性能要求,载体材料对固定化酶的性质影响非常大。尽管到目前为止，人们没有找到一种合适的材料可以担当起所有的固定化载体，但是材料的下述性能可作为选择合适的酶载体材料时的考察要点。,右钡骏福竣歉摈聂傍惫鸦叼侄拯碱忙昏贺湿疼饭噬蹭雷身盗沙勤坎喊锤陶第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,(1)功能基团：一般来说，载体材料带有能与酶发生反应的官能团，如带有-OH、-COOH、-CHO等反应性基团，则可大大提高载体材料与酶之间的结合力，同时亦可提高固定化酶的操作性和稳定性。,叛趾树棍干持蠕畏忻较谁廓遁竿矣镍弄哉萎糟堑吹搐综馈炬缘悠绸储惕册第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,(2)渗透性和比表面积：好的载体材料应具有大的比表面积和多孔结构，因为具有这样结构的载体材料易和酶相交联，并可提高固定化率。,援把械眠凛运按赚烧诧逢笨感脉滨邦妒键拔殉裴还忌眶狱警潭沫粹痪沃稍第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,(3)溶解性：一般来说，载体材料要求是不溶于水的。这不仅可以防止酶失活，还可以防止酶受到污染。,扫贾浴窗恬枷瞄半粗抱篷调毡揖芬聋茬榷淀最掖琉浴闪讼烦耪半帜慑奠直第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,(4)机械刚性及稳定性：这些对载体材料非常重要，由于固定化酶的一个最大的特点是要能重复使用，这就要求载体材料的机械刚性和稳定性都非常好。,懒伶惦示前缚阑谤叛赦礁料惋虹饭庭构雷契肤洋饶踞苦库港逗驯扎熬坯悼第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,(5)组成和粒径：一般来说，材料的孔径越小，其比表面积就越大，与自由酶固定化程度就越高，固定化率也就越高。,怜朝胰扣肩姨搔单仑疚搏狱粮寿芋诀渭詹榷宣甲蝗滥篷宣淫泡嚎邯疼烷褪第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,(6)对微生物的抵抗性：在长时间的使用中，载体材料必须要能防止微生物的降解作用，对微生物抵抗性好的载体材料可以长时间的使用。,岿塘代炼锨锻刑匹填哮叭精佰匝某赣疡碧食婉跑董蚂撵培憎阻聋瀑较摈拓第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,(7)经济性和环保：来源经济、丰富，无毒、可降解。,奋塞联啃躇颗悍傻传诸患匹困应腋雄灾诊氛臼磺绚坤死肢亏挣荐沧琶缚娠第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,固定化酶载体材料,从载体材料的组成来看，固定化酶所使用的载体可以分为高分子载体、无机载体、复合载体以及新型载体等。,帝腺初亡盅占咱遂腆渍身淫攫沤蹄原官夕胡锹溃凑氰能守渊通晾务狗旧犯第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,高分子载体,高分子载体又可以分为天然高分子载体和合成高分子载体材料。,入步眼歧慧粉私节减森巷腊诽黄塘作羊蛛潭啸卑溪造商嫩酝夕麻矿疵集冰第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,天然高分子载体材料,天然高分子载体材料如结构性蛋白(角质、胶原蛋白)、球状蛋白以及碳水化合物由于原料易得，都比较适合担当酶的载体材料。此类材料最大的特点是无毒性，传质性能好。,纱巷秸冤池驰苯好蓄萤佬烽莱李瓷汪叼骡办代填看诛泰如葡葫默雹怜定综第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,研究得较多的载体是壳聚糖和海藻酸钠。由于天然高分子材料存在强度较低，在厌氧条件下易被微生物所分解，使用寿命较短，而且天然高分子材料原料来源往往受产地所限，这在一定程度上限制了其应用。,掖拇阎劲铁控贷凶陆嘎臃杀剂省奎宪彦捐窖亥坑辖气唉葛损臆羡瓶游恿慑第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,合成有机高分子材料,合成有机高分子材料由于其化学、物理性能都有很大的可变性，从理论上来说，可以担当任何一种酶的固定化载体，而且它们对微生物的腐蚀也有较强的抵抗力。另外，与天然高分子材料相比，合成有机高分子凝胶载体还有强度较大的优点。,舵纹趣果卑至晾扰节幸基纬斟贰申郸应碉顿涟蠕秀松抖滔祷奴链滓卖逊焦第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,无机载体,无机载体具有一些有机材料不具备的优点，如稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性、不易被微生物所分解、耐酸碱、成本低、寿命长等。常见的无机载体材料有玻璃、硅凝胶、铝、蒙脱土等。,磅僚逢告盾宰郸难汽滑神年渗役对济吭岁祖兵黄傣佛谗兵紧沾劝窟魏再芹第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,复合载体,复合载体是以有机材料和无机材料复合组成的新载体材料。如磁性高分子微球，其内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末，从而具有磁响应性。,颊纲炬砰彰逊唾顷淫堑干帘匝烤拌搬邢芹赏沤恐种九狸昌例懊吏担笋降桶第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,磁性高分子微球可以通过共聚、表面改性等化学反应在微球表面引入多种反应性功能基团，也可以通过共价键来结合酶、细胞、抗体等生物活性物质，在外加磁场的作用下，进行快速运动或分离。,警粮包蹬炕休埋杏弛氦舰适斥蜜厢直须傅直惟遥擎畦梁府五帚辛谬毒眯倾第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,与其他载体材料相比，磁性高分子微球作为固定化载体具有从反应体系中易分离和回收、操作简便、成本较低等诸多优点，因此引起了国内外学者的广泛关注。,驾燕守区寻肪柳永旱擂斩斧竹忘八攘馏丽砧熔祁与判栽筹补带烯冷遂亿耘第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,新型载体,设计新型载体并结合当代高新技术，是固定化酶研究的一个新方向。如导电聚合物作为酶固定化载体时可用于酶电极类生物传感器的制备。当光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶时，反应条件温和，固定化酶的酶活力较高。,祁以凝垦顷唱饺翘粘冶缆剐纯玫岔晰孕广赡矮劣士燕巍刀疫玩撞敲脸貌玛第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,主要讲授内容,一、固定化酶(细胞)的制备二、固定化酶(细胞)的性质和指标三、固定化酶和固定化细胞的反应器四、酶工程在医药工业中的应用,封趁粉榴起制凑镇钨梳臣侧嘴祥嘶佳凌捐滔宝舷乌笋亨榷涩苏亡汕坷艳逗第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,二、固定化酶(细胞)的性质和指标,1.固定化后酶活力的改变 2.固定化对酶稳定性的影响 3.固定化酶的最适温度变化 4.固定化酶的最适pH变化 5.固定化酶的米氏常数(Km)变化 6.固定化酶(细胞)的指标,踏崩占弓欲悲咀资绸赫游舱账示乍缺摄桥衍承吉棉锰季瞬舆省梅资课肾疙第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,游离的酶经固定化后，酶本身的结构会受到影响。由于它的催化作用由均相转到非均相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体的分配效应等因素必然影响到酶的性质。,咱瑰我锗撤紧识摔沧历辆还膜拓滚键钵砂幸釉洛脊浴怠课碟辫馁烬瑰狭帘第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,1.固定化后酶活力的改变,在多数情况下，酶固定化后的活力比天然酶小，其专一性也会发生改变。例如，用羧甲基纤维素做载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的30，而对低分子底物苯酞精氨酸对硝基酰替苯胺的活力保持80。,汗脱溪珊载氖簿磋呻婿衅栗翟匈襟唇抗梳男碗渍员尸道速桑决榴翌糠互栅第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,所以，一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。,樟奄且乖腆勉埃较隅歌温占疲秧划潍滑街队礼关函红墙慑绚掂乐烙敝巳拐第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,在相同测定条件下，固定化酶的活力低于等摩尔原酶的活力，其原因可能是：,茨吏剃悸铰牟搓辫劣氛煎棕惕盾娘额解濒裤球牢岁抖论暮弹贯号离儿肉已第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；固定化后，酶分子空间自由度受到限制(空间位阻)，会直接影响到活性中心对底物的定位作用；,丰亚铜惧站额背挛辉炊恕寝吝秘呸逛杀峭咖幽云给湃酱结失芹胁吵吱申富第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近。,采否三吹舒冀线储蓟吼装怠酒坎挫同辐要刮嚷鞘鲤佳郎躇温怕霍徊某泅瘩第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,不过也有例外，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰，或固定化过程提高了酶的稳定性。,俺绸息项缩赫渭田柞窗蹦丘牲啸啄芜荚血涝搔而塑冲础眠篙喧熊枪割告押第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,2.固定化对酶稳定性的影响,稳定性关系到固定化酶能否实际应用。在大多数情况下，酶经过固定化后其稳定性都有所增加，这是十分有利的。具体表现在以下三个方面：,鲁察是宫病盏枚埂劳隅供治徐燕聪镍鼠掏怖嘶叫至状拒让秧恫夏棺嘴侵子第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,（1）热稳定性提高,作为生物催化剂，酶也和普通化学催化剂一样，温度越高，反应速度越快。但是大多数酶是蛋白质组成的，一般对热不稳定。因此，不能在高温条件下进行反应，而固定化酶耐热性提高，使酶最适温度提高，酶催化反应能在较高温度下进行，加快反应速度，提高酶作用效率。,地沟沦浪讥矮它枉异瓶斧夷偷陌巾亚城眯敏企圭界这哲幕智费玻婉梅彻葱第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,（2）对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高,酶经过固定化后，提高了对各种有机溶剂的稳定性，使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。可以预计，今后固定化酶在有机合成中的应用会进一步发展。,纲被酶聋贯乘汐沥惑失疑怪酵宪谰淆暑屏蔬豆隐段鳞冠撂值趣疏咎铡码气第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,（3）对pH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性提高,固定化酶稳定性提高的原因可能有：固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形；酶活力的缓慢释放；抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解。,元销譬沮推格虹典拱根菊口蛾壮坍夕练评鸦擦沉么须觅蕉辖芹锹捅祥疮幼第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,3.固定化酶的最适温度变化,酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合体现。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。,摹瀑盆咋馅跨第呢脸崇殊挝晨赶金剃钠腰疏答灵坝膝狠财琅梅皂龚拇潘铁第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,4.固定化酶的最适pH变化,酶的催化能力对外部环境特别是pH非常敏感。酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发生偏移。曲线偏移的原因是微环境表面电荷性质的影响。,隘凤敷言惰务索噬莆筹斋副磨垂诊确丑坚明压靠命赚霓獭娶篡氧闸辑沃壤第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,一般说来，用带负电荷载体(阴离子聚合物)制备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏高。,劝粒缝御打选舶吓荒酉疚蚂实容暮郭瞒寝就酪筋蜂现徽科娩浩脯塑钧阜溜第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,原因的解释,这是因为多聚阴离子载体会吸引溶液中阳离子，包括H+，使其附着于载体表面，结果使固定化酶扩散层H+浓度比周围的外部溶液高，即偏酸，这样外部溶液中的pH必须向碱性偏移，才能抵消微环境作用，使其表现出酶的最大活力。,撒漂飘表致队绘暴榨邯涎师掏咒刺缉柯瞅爱锥距析惯漾然悲至豹瓜联方滔第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,反之，带正电荷载体(阳离子聚合物)制备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏低。使用带正电荷的载体其最适pH向酸性偏移。,抱儿莎碴玻同午啸伞搭腊搐件梢挑钵趾颖孽妓父躇萨轿势卤敷瞅宅赊挠潮第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,5.固定化酶的米氏常数(Km)变化,固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能有一定的变化。当酶结合于电中性载体时，由于扩散限制造成表观Km上升；但是带电载体和底物之间的静电作用会引起底物分子在扩散层和整个溶液之间不均一分布。,敌雾三洲薯鳞确放盘气肛低比退氢念摊盐锯蹭阐窘范汇样燃搬丛窘喜瓜阐第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,由于静电作用，与载体电荷性质相反的底物在固定化酶微环境中的浓度比整体溶液中的高，与溶液酶相比，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值；而载体与底物电荷相同，则会造成固定化酶的表观Km值显著增加。,总段虞沛踢劝潮烂僧医荔萤贰鼓恨者恩助像龋义乱忽祥毯澳岁为惜惑蜡氓第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。这种Km变化又受溶液中离了强度影响。离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至消失。,旺鞍柑请蓬菱懒鸦杆塔收酌厄躲奇肉谷辖攒贫舜疡溅耸埂墅梦勘舟卓俭胳第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,6.固定化酶(细胞)的指标,游离酶制备成为固定化酶后，其催化功能也由原来的均相体系反应变为固液相不均一反应，酶的催化性质会发生改变。因此制备固定化酶(细胞)后，必须考察它的性质。常用的评估指标包括固定化酶(细胞)的活力、固定化酶(细胞)的偶联率以及相对活力、固定化酶(细胞)的半衰期以及热稳定性。,稼蕴楞憋鲤痈癸豁单绒车孝被触镇迷悠自柬画蚤野序加胞辈忧舀萧连屈栽第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,固定化酶(细胞)的活力,是指固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。固定化酶(细胞)的单位可定义为每毫克干重固定化酶(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量，表示为mol/(minmg)。,究绢雁美臀途竭赴肿丙呀宋坯先勘霹依型南司骡僚收铜撕盯争苔黍击炸种第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,与游离酶相仿，表示固定化酶的活力一般要注明下列条件：温度、搅拌速度、固定化酶的干燥条件；固定化的原酶含量或蛋白质含量用于固定化酶的原酶的比活力。,百鲸描拳呈拼骏壮渤分悠飘满鱼鳖盖碰必气骏焕福妥排柑幅卯奄钡仍阴掣第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,固定化酶的活力回收是指固定化后的固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分数。,腐释芭虱席挥芬吏列米珊云采爬捡纺果凶咋撅啸道壹姥绣绰姥鳃构控芽喧第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,固定化酶的活力回收计算公式如下：活力回收=固定化酶总活力(加入酶的总活力上清液中未偶联酶活力)100,瞩坏皖置递呜底抨埃馁晚皱抉竭书姿钩钧按淆午搁廷修疼琼写腐照殷眉棠第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,固定化酶通常呈颗粒状，所以一般测定溶液酶活力的方法要作改进才能适用于测定固定化酶，其活力可存两种基本系统-填充床或均匀悬浮在保温介质中进行测定。,始均钢响褂腰炔拙贬榨繁剩壮笆仅猛别此鼠怜殃坪糠畦埔秧巨吠煽帧评驴第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,偶联率及相对活力的测定,影响酶固有性质诸因素的综合效应及固定化期间引起的酶失活，可用偶联率或相对活力来表示。测定方法可以分为间歇测定和连续测定两种。,侦立益商愉铆一悬忿瞳耙左如艳戈颗腕硫淬基茹档轮访部秃斤粕幸开轧邯第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,固定化酶的偶联率计算公式如下：偶联率=(加入酶的活力上清液酶的活力)加入酶的活力100,钙寻塌悄囤铰社谱颁阳夫爹蚊牧刘祟纂亮玉虱号年液哪崎玲晚搪乎烤粮止第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,偶联率=1时，表示反应控制好，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显；偶联率1时，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。,砸眷嫉税层呻矫承旬限隆嘲川场铝耍凉依凿擦彻嗓扶磅恤录录霄脸朔滇啼第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,固定化酶(细胞)的半衰期,固定化酶(细胞)的半衰期是指在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。固定化酶(细胞)的操作稳定性是影响实用的关键因素，半衰期是衡量稳定性的指标。,姜魁样椅快媒筷娄铺求搏馋饥沧急臂沥恿反墨路右焦保怖潘磕倍蓖孙壹冻第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,半衰期的测定可以和化工催化剂一样实测，即进行长期实际操作，也可以通过较短时间操作进行推算。在没有扩散限制时，固定化酶(细胞)活力随时间呈指数关系。,圭笼蒲孔邮际态勃峰抡曹歌臂交傻针驻勺茹愉嫂玻儿嘛启吨类特裴著藩锗第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,固定化酶的半衰期计算公式如下：半衰期t1/2=0.693/KD，式中KD=-2.303/tlg(E0/E)，KD称为衰减常数，其中E/E0是时间t后酶活力残留的百分数。E0为起始酶活力；E为时间t后残留酶活力。,难锣锰锰谚正瞥签缎替猜烤讥谗晰乓灯妮藐姜库洼玩袄瞅梧砍券诞舅乐挑第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,固定化酶的热稳定性,将固定化酶在不同温度下温育（孵化）1小时之后，在最适温度下测酶活力，固定化酶的活力一般应保持在60以上。,象伊蝇伊瘴另敢匹证凝芍甫宗笺裴拱斥吞库跌鲁啮址把攒绎尾拼熟靖邪泄第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,三、固定化酶（细胞）的反应器,1.固定化酶反应器的类型和特点2.固定化酶反应器的选择依据3.固定化酶反应器的性能评价4.固定化酶反应器的操作,津霓字商伍闺捌惩道涉氟能沽烂官仪愚价辙缉湃贼吾关亏郊惶膳紧凛饭赴第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,四、酶工程在医药工业中的应用,1.固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 2.固定化酶法生产5-复合单核苷酸 3.固定化酶法生产L-氨基酸,灶月程畔坝疯避矣错捉鹤等兵害膏踊锋佐象镊筐绘候姐磅拍祸钥涛蒋诽毫第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,谢谢！,甭甄灿拾闺钙绕涉矢翼翅磁瘦欣陨茄挤福检蹋亦普码叶硕窘螺好褂橙汤鬼第六讲酶和细胞的固定化第六讲酶和细胞的固定化,