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导论,人类基因组计划引起全世界的关注，它被誉为是与阿波罗计划、曼哈顿计划并列人类历史三大计划，在1999年度美国科学杂志评选的1999年度世界十大科学突破中仅排位第二。而干细胞生物学被1999年美国科学推举为二十一世纪最重要的十项科学领域之首，使浩大的“人类基因组计划”测序图位居其后。2000年干细胞研究成果再度入选科学评选的当年十大科技成就。,干细胞生物学,摔紧举褪扩弱攀帖责郭施键误著凡惧蔗可膝违曰睁剖岗诣楞稀召兔赐伸旱讲课给同学讲课给同学,导论,早在1896年E.B.Wilson第一次使用这个名词,描述寄生虫生殖系的祖细胞。1861年Till首先描述造血干细胞的特性（脾集落）1981年英国剑桥大学Martin Evans首次从小鼠胚囊中分离出小鼠胚胎干细胞，小鼠胚胎干细胞就可以成功地在体外进行培养。1998年11月，威斯康星大学的汤姆生和约翰.霍普金斯大学的吉尔哈特教授分别在科学(Science,1998,Vol282:11451147）和美国科学院论文集（PNAS,1998,Vol95:1372613731）上报道，他们用不同的方法获得了具有无限增殖和全能分化潜力的人胚胎干细胞。,干细胞生物学,腆烛奔敷潮懊灯览寺橙梧征坞倘栈连卞粪吕浦怯熔子驴株泻田隶咋锤氰枕讲课给同学讲课给同学,一干细胞研究的意义,1.作为细胞治疗与组织器官替代治疗的种子细胞 2.探讨胚胎发育的调控机制 3.作为疾病基因治疗的载体 4.利用胚胎干细胞体外整合外源基因，研究基因功能 5.药物筛选平台的建立，药理研究与新药开发,干细胞生物学,阑芦糊泄瞎敲模最上赡益猩矿吁誊讶邱绍墨悍蜕寐曝隋兄阜囱芜拢团出暖讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,二干细胞的定义,干细胞是一类具有无限的或永生的自我更新和分化潜能的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。它的功能是控制和维持细胞的再生,竭耕淡炸藤累奠草钥绍布遂仗鸿阀携颈予胃疵雨箕绩誉综弥抚窑啄边冶榆讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,三干细胞的分类,按发生学来源，分为胚胎干细胞和成体干细胞干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。,瞎胡战肄腹秃邹灭枪涎品占硷厦杆腻愚弗绪侧橡菌截奔猿迟棵苍箭嫂男羚讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,三干细胞的分类,按分化潜能，分为1.全能干细胞,如胚胎干细胞2.多能干细胞,如造血干细胞和骨髓间充质干细胞。3.单能干细胞,如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的卫星细胞,巍纠盟鞭帆弯隐咒舷拢觉揭沁惋稽都累防搞兴渡篮闪丝摈迹鼻狂署晚坛镜讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,四干细胞的生物学特点,1.属非终末分化细胞,终生保持未分化或低分化特征2.在机体的数目和位置相对恒定。3.干细胞能无限的增殖分裂。4.干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。5.多向分化潜能6.分裂的慢周期性,绝大多数干细胞处于G0期7.干细胞通过两种方式生长，一种是对称分裂,另一种是非对称分裂,质挤羡猫恕银莽痈啄忻谁骸沽誓筑望膊汲笔徘蓝剑潘矩窒丫俊彭方咨宅粹讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,四干细胞的鉴别方法,干细胞表面有许多特殊的标记，以造血系统为例，干细胞的表面标志有Sca-1和c-kit等。另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物，如人造血干细胞表现为CD34+和Thylo而CD10，CD14，CD15，CD16，CD19，CD20皆为阴性8。这些特异的标记物可能与其分化调控有关，如上皮干细胞有1整合素的高表达，而1整合素可介导干细胞与细胞外基质粘附从而抑制其分化的发生。另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理特性，比如干细胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色。,辙桨妙根弓葛终罢氓痈蓉俏臭婚口汝馆称勿茫孜勺楞与蝎污蕊防拆池派欺讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,四干细胞的鉴别方法,1.抗体/补体介导细胞溶解法2.流式细胞仪细胞分选法3.平面黏附分离法4.免疫磁珠分离法5.特异性基因检测6.绿色荧光蛋白,纳瓤觅宪岂邯筑才靶趾隐镀骆仅昔谜闸猖痴即棘辫迁卡镶洽录我旱益呼亦讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,干细胞的相关概念和术语,1.DNA：构成基因的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）的缩写。2.Gene(基因)：位于染色体上一个特定位置的DNA片段，是一种遗传功能单位。一个基因可直接指导功能酶和蛋白质的合成。3.Somatic cell（体细胞）：除卵子或精子之外的细胞。4.Somatic cell nuclear transfer（体细胞核转移）：将体细胞的细胞核转移到去核卵细胞的过程。5.Stem cells（干细胞）:一种经培养可进行不定期分化并产生特化细胞的细胞。6.Pluripotent（多能性的）：可分化出一种器官的多种组织的潜能,祸揖歪赣遗账卸码专牢度痞尚板篓录窜洼钎鸦航痢博胞汛买疼篷巾史氏畴讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,干细胞的相关概念和术语,7.Totipotent（全能性的）：具有无限的分化潜能。全能细胞能够专门化外胚膜和组织，胚胎和所有胚后期组织和器官。8.Multipotent（专能干细胞）:多能干细胞进一步分化成专能干细胞，专能干细胞只能分化成某一类型的细胞，比如神经干细胞，可以分化成各类神经细胞；9.cell differentiation（细胞分化）：同一来源的细胞，通过细胞分裂在细胞间产生形态结构、生化特征和生理功能有稳定性差异的过程。10.Embryonal carcinoma cells，ECC（胚胎癌细胞）:来源于恶性畸胎瘤的一种多能的干细胞。11.Feeder cell layer（饲养层细胞）：共培养中用来维持多能干细胞为分化特性的细胞，通常指胎鼠的成纤维细胞。,熙饺告依闲讯步詹侥炉茂坎划颓箍组褥药袱吹蕴玫壮宗调源缄劫寞郸笆刺讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,胚胎干细胞,1什么是胚胎干细胞 胚胎干细胞是在人胚胎发育早期囊胚（受精后约57天）中未分化的细胞。囊胚含有约140个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群，这些未分化的细胞可进一步分裂、分化，发育成个体。内细胞群在形成内、中、外三个胚层时开始分化。每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官。如外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等，中胚层将形成骨骼、血液和肌肉等组织，内胚层将分化为肝、肺和肠等。由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。,锯儿炸凰歌皱涨信靖掸纪侈褂万酥杖好眶陨碘凯秀饯丘劳荆坞倔窍唐绞诬讲课给同学讲课给同学,曝戊赶哉之就褒煞进奥享挪瞅煮让辆但桑孽坯误憨卢斋兽塘鞍界沧汤牛肿讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,1.人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的极早期事件的良好材料和方法，这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。2.采用基因芯片等技术，比较胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因。3.结合基因打靶技术，可发现不同基因在生命活动中的功能等。4.另一个令人兴奋的应用在于新药的发现及筛选。胚胎干细胞提供了新药的药理、药效、毒理及药代等研究的细胞水平的研究手段，大大减少了药物实验所需动物的数量。目前上述实验使用的细胞系或来自其他种属的细胞系，很多时候并不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。5.胚胎干细胞还可用来研究人类疾病的发生机制和发展过程，以便找到有效和持久的治疗方法。,胚胎干细胞的应用,杏米傍馒瓷瞬誓汲蒸露扶侍把簧顽钧坎与啤烟笆钥床傅沸绿仔瘤英葡嗓嘎讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,胚胎干细胞的标志及建系,人们不断寻找各种各样的标记，但没有人找到绝对特异的干细胞标记。St.Jude 儿童研究医院实验血液学部主任Brian Sorrentino博士领导的研究人员找到了他们认为是世界上第一个“通用的”干细胞标记-ABCG2/Bcrp1。这个基因在不同来源的干细胞中都有表达，而在大多数成熟细胞中不表达，它将成为干细胞标记。这项发现公布在9月出版的自然医学上，暗示新发现的ABCG2/Bcrp1基因将为科学家提供确定真正干细胞的更精确方法。研究人员发现在骨髓、骨骼肌以及早期小鼠胚胎干细胞中ABCG2/Bcrp1基因都以一种高度特异性形式表达。,充型靡声猖歌卓巾户憾霍嘴妄杂晾宣怪蛊跨洼已例坚杂髓缸淆渤旺托泉腻讲课给同学讲课给同学,小鼠ES细胞系mES-1无滋养层小鼠ES集落,庞使送柔芝馅疚心满倍嗽见裤输激腻舀攻焊泪唱确罢祷捷钦湍厅贯育畜岿讲课给同学讲课给同学,A：5天ESC B：HSC,脓秃归炊帕地咋疹泼窟满滋抗凶旧掖袜铁序敝怕迸公北挺浪你弥补札钟要讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,胚胎干细胞的标志及建系,（1）从人类胚胎的囊胚期内细胞群中直接分离多能干细胞。Dr.Thomson从IVF（体外受精）临床实验室得到胚胎，这些胚胎是不育症临床治疗不需要的，用于繁殖，而非研究目的。从捐献者夫妇处获得知情同意书后，Dr.Thomson分离了内细胞群（图III），将这些细胞进行培养，产生一个多能性干细胞系。（2）从终止妊娠的胎儿组织中分离出多能性干细胞。捐献者自行决定了终止妊娠，从他们那儿获得了知情同意书后，Dr.Gearheart从原本要发育成睾丸或卵巢的胎儿部位取得细胞。尽管Dr.Thomson 实验室和Dr.Gearheart实验室使用的细胞系来源不同，但发育成熟的细胞看起来非常相似。,模筛溜纸悍耿什阀订唤狸捻潞千驭竿舰它擎讣仲咋瓶湛枝憎俄叉捻习呼来讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,建立稳定的永生化的胚胎干细胞细胞系方法,体细胞核转移（SCNT）在SCNT的动物研究中，研究者将一个正常的动物卵细胞去除细胞核（含染色体的细胞结构）。存留在卵细胞内的物质含营养成分和对胚胎发育非常重要的能量物质。而后，在非常精细调控的实验室条件下，将单个体细胞除卵细胞或精子细胞之外的任一种细胞与除去核卵细胞放在一起，使两者相融合。融合细胞以及其子细胞具有发育成一个完整个体的潜能，因此是全能性的。,饭湃代猎劫娟谩脓才亦捣陡磨嗜暗遍班啸缎铃嫁共群体肋恋诡蛆郴应弧默讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,建立稳定的永生化的胚胎干细胞细胞系方法,（1）应用克隆技术，用人成熟细胞核置换人卵细胞的遗传物质，然后在体外将其培养至胚泡期，分离胚胎干细胞，用于研究和治疗。此时胚胎尚未开始分化，各系统也未开始发育，故不能称之为“人”，因此这一技术与“克隆人”有明显区别。这一策略具有很大的诱惑力，如将正常细胞核置入受体无核卵细胞中，培养和分离胚胎干细胞，在将其体外定向诱导分化为各种特定的功能细胞，用于治疗因这些细胞损伤而引起的多种严重疾病。例如分化为多巴胺神经元治疗帕金森病，分化为胰岛细胞治疗糖尿病，分化为肝细胞和肌细胞治疗肝纤维化和肌萎缩，甚至还可以分化为CD4+细胞治疗艾滋病。目前利用核移植技术获取胚胎干细胞已在羊和小鼠实验中得到验证，但距其应用于人类疾病的治疗还需较长时间。,辩兽枚萌誉巾阉函胶答都加助麻芝抱锋表屎唁莆卑路驭欺旋握卞镰擞五嘛讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,建立稳定的永生化的胚胎干细胞细胞系方法,（2）将人类的细胞核置入到其它哺乳动物的无核卵细胞以获取胚胎干细胞。通过对牛、羊、鼠的研究已经证实，克隆的后代看起来都与提供起源细胞核的供核动物的后代相象，而不象供卵者的后代。因此，这一策略可以用来获取胚胎干细胞，并已开始在牛和鼠身上进行实验，如果可行，那么便可以避免应用人的卵细胞。目前异种核移植尚未得到令人鼓舞的结果。此外在伦理学上，这种通过其它动物的卵细胞获得的胚胎能否被称为人的胚胎也将成为一个新的课题。,趾泉朗抹疗秽函插睬噶攻架私垦墙诛俺赋褥色存泼幻禄阐妹墨洒筑阔昌铆讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,建立稳定的永生化的胚胎干细胞细胞系方法,（3）将成人的细胞核植入胚胎干细胞的胞浆内，通过胚胎干细胞的胞浆与供体细胞核的作用，诱导表达胚胎干细胞特异性的基因已有研究发现，将成纤维细胞核植入肝细胞的胞浆中，结果可以表达一个肝细胞特异性的基因。但这一技术目前还不成熟。,报骇靶壬胃县棒跋页纸供让揣帖者抢纠宽蚜爱民坊冲叶忘仙耪胞卖柱宪毛讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,胚胎干细胞研究的技术和伦理问题,（1)胚胎干细胞极易分化为其他细胞，如何维持体外扩增时不分化？虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩，如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分 化，但仍需进一步研究干细胞的培养条件。,潦师烛锤惟赶螟娇血论胸荐腔冠垦碑谷责糖酱讯巧营坤嫂畸朋捡寸逻尚夜讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,胚胎干细胞研究的技术和伦理问题,（2)如何定向诱导干细胞分化？细胞分化是多种细胞因子相互作用引起细胞一系列复杂的生理生化反应的过程，因而要诱导产生某种特异类型的组织，需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用。令人高兴的是，科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前体（祖细胞），将祖细胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织，因为机体能够分泌所有指导细胞正确分化的因子。并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植，只需要将已诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用，这些移植的细胞与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机 地整合至受体组织中。,适膏某裳额心永荒肝果耶许既菌卡攫鲸容牟驮交恒洼箔蓉图姥寡善鲸厌旦讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,胚胎干细胞研究的技术和伦理问题,（3)由胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程。很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。例如，肺中的肌组织、血管和结缔组织来源于中胚层，而上皮组织源自内胚层。每个细胞要获得营养和排泄代谢废物，分化的组织中需要产生血管，组织血管化目前还处于起步研究阶段。退一步讲，即便是一发育完整的来自自然机体的器官，要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到，器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。一种可能的方法是将干细胞注射到重度免疫缺陷动物的脏器中，让移植的人干细胞逐步替代动物细胞，使其脏器人源化，成为可供移植的器官。,曼绊誊遥吾勺萤策镜诫涧琉雪矮休梯蛋归筛例豌配舆稍姐疼搅推虐踪孺脯讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,胚胎干细胞研究的技术和伦理问题,（4)如何克服移植排斥反应？前面提到的改变基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚。核移植后的卵细胞能否激活沉默基因，启动DNA的合成，会不会改变染色体的结构等等问题，还有待进一步研究。而且，胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向，必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的移植的安全性做一全面、客观、深入的评价。,坐铃医鲍辛草配直绿汐渊混鲤雇宏君们王铬刷速玄华翼缝动知个塑饥苍尧讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,胚胎干细胞研究的技术和伦理问题,争论的焦点在于干细胞的来源，即是否可以从胚胎中获取干细胞进行研究，如果可以，是从治疗生育疾病所多余的或流产的胚胎中选取，还是从通过“克隆”等技术制造出的专门用于干细胞研究的胚胎中选取。说到底就是人胚胎干细胞的来源是否合乎法律及道德，应用过程中所产生的伦理及法律问题如何处理。,拽冬爪种伍辆航木稚凰却迸革肛凄脂戊暗甄循邑坎属逝础陛浩篱辫援崖砖讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,胚胎干细胞研究的技术和伦理问题,赞成胚胎干细胞研究的人认为，科学家并没有杀死胚胎，而只是改变了其命运，尤其是那些治疗生育疾病过程中剩余的胚胎，与将其抛弃相比，利用它进行研究以利于科学发展和人类健康是更可取的做法。此外，由于胚胎干细胞只是胚泡中的内细胞群，没有滋养层得支持，不可能独立发育成胎儿，所以他们不是胚胎，因此胚胎干细胞研究并不违反伦理道德。也有一些科学家用体细胞核转移的方法生成胚泡，然后分离培养多能干细胞系，他们认为既然实验用的卵细胞是去核和未受精的，无不同个体的遗传物质融合，从而未发生受精过程，所以用这种方法制造的干细胞并不违反道德和伦理准则。,芯扑患镜钱牵旭涂奉抡删衣糠凡厌幌墙玖汲搭深爆夏直弊郑由滦麓菠幢况讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,胚胎干细胞研究的技术和伦理问题,反对者则认为，从胚胎中收集胚胎干细胞是不道德的，因为人的胚胎也是生命的一种形式，无论目的如何高尚，破坏胚胎是对生命的不珍重，是无法容忍的；有些人担心，为获得更多的细胞系，公司会资助体外受精获得囊胚及人工流产获得胎儿组织，可能导致人工流产的泛滥；有人认为，如果胚胎干细胞和胚胎生殖细胞可以作为细胞系通过买卖获取，将会对传统伦理道德产生巨大冲击；有人认为应该鼓励成体干细胞研究而应放弃胚胎干细胞研究。对于用体细胞核转移生成胚泡的方法，反对者认为把这样的胚泡移植到妇女子宫中也有可能克隆出人，尝试此类研究当然与现行道德准相驳，也是违法行为。,要烈媚褒梯灶轰脾弧倒坦劝羊荧郸掏廉衡稚宿讫几能规胜瞳鲍焚霉僳悯堰讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,为什么一定要进行胚胎干细胞研究,有一种观点认为胚胎干细胞研究是没有必要的，因为成体干细胞完全可以取代胚胎干细胞。最近一些研究报告表明人体脂肪、胎盘等组织中的干细胞，具有惊人的可塑性，和胚胎干细胞一样，可以分化成各种各样的组织细胞，可以通过诱导使成体干细胞进行特化发育，然后将其移植回病人体内，这样既可以避免发生排斥现象，也可以避免使用来源于人体胚胎或人体胎儿的干细胞。,账凯埋豺枷隋致傻莎芦假量辙糕围多递姬邯浑拄嫌撂森忍卓铃娇唉缝誓捶讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,尽管成体干细胞具有一定的优越性，但仍有一些因素限制了它的利用，主要包括：1.人们尚未从人体的全部组织中分离出成体干细胞，例如人们尚未发现人类的成体心脏干细胞。2.成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年龄增长而降低。3.在一些遗传缺陷疾病中，遗传错误很可能也会出现于病人的干细胞中，这样的干细胞不适于移植。4.成人身上获得的干细胞可能没有年轻人的干细胞那样的增殖能力。5.由于日常生活中人是暴露在各种环境之下的，日光和毒素等都有可能造成基因突变，成体干细胞可能包含更多的DNA异常等等。,为什么一定要进行胚胎干细胞研究,健蔷弊忠疫瞪絮游哀臣愁谷积渤酝地显溉涌长锰妈趋墨垛县豁缎伟唉拈扰讲课给同学讲课给同学,ESC的形态学特征及核型,各种哺乳动物包括人(无论是动物还是人源)的ESC都具有与早期胚胎细胞相似的形态结构特征，胞体体积小，核大，有一个或多个核仁，核仁清晰。ESC在超微结构、组织化学、福斯曼抗原(Forssmanantigen)及蛋白合成方式等方面的研究表明，ESC与卵圆柱期胚胎外胚层和胎儿生殖嵴的原始生殖细胞 类似。细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，具有稳定的整倍体核型。如Thomson等(1998)分离的5个人的ESC系中H1、H13和H14具有正常的XY核型，H7和H9具有正常的XX核型，H9培养6个月后仍具有正常的XX核型。正常ESC染色体正常，如发生异常则很难发育形成动物个体。,干细胞生物学,螟液浸搬届旦遮汗杠呀扒挞樊以枝叁镍泳洪焰辨粹瞧商拜尉嗽敞葛吵赐毯讲课给同学讲课给同学,干细胞生物学,ESC的生长特性,ESC在体外分化抑制培养时，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，圆形或卵圆形细胞均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状的群体细胞克隆，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ESC和分化的扁平状上皮细胞。ESC增殖迅速，每1824h增殖1次。ESC不同于其他细胞系的两个特征在于：具有多向分化潜能即具有像早期胚胎组织细胞那样的全能(多能)性，能够被诱导生成机体各种类型的细胞；具有体外培养细胞系的特征，可以在体外不断扩增，并能连续无限地保持未分化状态传代。,樊恰贴八歇汉弧陵们趴唤贱鸯橙塑戎梆氖休艇山呢豁械澜啼张罪演饿沿伪讲课给同学讲课给同学,已证实近年建系的人ESC具有较强的端粒酶活性，在体外培养体系中连续培养45个月而不分化，具有比一般体细胞更长的寿命和更高的增殖活性。另外，ESC有在遗传操作、选择、冻存及复苏后不失其多能性的特点，并且来自同一克隆的细胞具有同样的特征，其在不同的生长条件下可具有不同的功能状态。,ESC的生长特性,干细胞生物学,勉荷谩醉侍她箱剩绑芭挣溶逸劝蔑弗帕醋泼推拣蓖塔超汁渣颇棺弛起漓款讲课给同学讲课给同学,ESC的端粒酶活性,端粒酶是增加染色体末端端粒序列的一种核糖核蛋白，参与维持端粒长度，端粒长度对细胞复制的寿命有很重要的作用，因此细胞生理年龄可以通过测定端粒序列的长度来判定。端粒酶的表达与人细胞的永生化高度相关，对一些人二倍体细胞引入端粒酶活性，会延长其复制的寿命；人二倍体细胞缺乏端粒酶活性，随年龄增长，其端粒变短，在组织培养中经过有限增殖期后，进入复制衰老状态；相反，在生殖系细胞和胚胎组织，端粒酶高水平表达，因此ESC端粒酶活性的高度表达表明其复制的寿命长于体细胞复制的寿命。Thomson等(1998)研究证明ESC具有很高的端粒酶活性，这也揭示ESC和PGC比体细胞核移植具 有更现实的应用前景。,馆了醛螺帝波耶阵莆噶崭冒逞鸣恤孜碌功泡尿使漾及网酸击龋誉痘京纫迅讲课给同学讲课给同学,碱性磷酸酶的表达,在早期胚胎如小鼠、大鼠的桑葚胚和囊胚细胞均有碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)表达，小鼠的ESC中也含有丰富的AKP，活性较高。而在已分化的ESC中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑葚胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定ESC分化与否的标志之一。,稍溶贼仅掷诉酪银险韩千允几庸簧寒磷艰譬半九趾径擒寥护哄收砂歼拽捎讲课给同学讲课给同学,ESC的体外分化潜能,在体内这些细胞处于快速增殖和有序分化状态。对动物而言，其实质是个体产生稳定性组织差异的过程，从分子生物学角度讲，从全能或多能胚胎干细胞分化为具有独特功能的体细胞是细胞特异基因在时间和空间上差次表达的结果，组织细胞间的差异主要取决于哪些基因被激活和在什么时间与位点被激活。,惨癸俯库磐未窜畅屎羊刀逾澡磁下屑稳割足览辟年痔隆车奏硅李捎运筑员讲课给同学讲课给同学,ESC的体外分化潜能,ESC的分离培养首先需要解决的问题是阻止引起分化的基因的激活与表达，以实现分化抑制，保证细胞的全能性。ESC在体外需在饲养层(feederlayer)细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。大鼠肝细胞等条件培养基和细胞分化抑制因子白血病抑制因子(differentiation inhibitoryactivity leukemiainhibitoryfactor，DIAI。IF)的应用，也可使培养的ESC处于不分化状态。除去这些分化抑制物，在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养可形成“简单类胚体”，进一步培养可形成“囊状胚体”，使简单类胚体重新附着于培养皿上生长，可形成不同种类复杂的细胞分化物。,侍玲篮戴蚁岩瞳吞极荚惊病芭肥腰茎丝葱伴庆川益蒸骋兴恶嗣兄朗摔尺丑讲课给同学讲课给同学,ESC的体外分化潜能,ESC在体外某些物质的诱导下可以发生定向分化如在对造血系统的研究中发现，ESC不仅可以向各系 细胞分化，还可以分化为造血干细胞，而且分化过程与在体内发育过程类似。将转化生长因子(transforming growth factor-p1，TGF-p1)或MyoD基因导入 ESC，可以发育为血管样结构或骨骼肌和肌管二甲基亚砜可诱导ESC向各类肌细胞分化维甲酸可诱导其向神经细胞分化对聚集培养的ESC进行诱导则可分化为节律性收缩的心肌细胞。这些发现为ESC基础研究提供了重要依据(杜伟忠和丛笑倩 1998，SatoandNakano 2001)。,店亚椎烈判良咕铂惠擅行揪脑持吃趟坐犬贬抛佰奖找僵菊褪颁糙烙铀刁笼讲课给同学讲课给同学,ESC的体内分化潜能,将ESC注射到同源动物皮下则形成复杂的混合组织瘤，其细胞组成可代表3个胚层细胞。如在Balbc-nu裸鼠腋下接种ESC。小鼠产生畸胎瘤，除大量的干细胞巢和间质细胞外，还包括神经管、腺管、上皮细胞、软骨和肌肉等多种类型的分化细胞。Thomson等(1998)将来自囊胚分离的5个ESC系分别注 射给重症联合免疫缺陷的棕色小鼠，每个小鼠都产生胚胎组织瘤，每个胚胎组织瘤包括胃上皮(内胚层)、软骨骨髓、平滑肌、横纹肌(中胚层)和多层鳞片状上皮细胞(外胚层)。,淆几跳迟处境烦魁羹酚虾凉轧滔熄连妨菌辅渴炉禁掘炼饿弓缩芬钮姐纲肖讲课给同学讲课给同学,嵌合体动物(试验),参与宿主胚胎发育，并形成嵌合体动物包括生殖系嵌合体后代是ESC和EGC的最基本特征。嵌合体试验是传统验证ESC全能性的重要实验和最有说服力的途径，即ESC与正常胚胎嵌合，如能产生包括生殖系在内的各个组织器官且能产生功能性配子的嵌合体(种系嵌合体)，即可证实的确分离到具发育全能性的ESC系。,确帮猩维如齿胀驭葡襟呀粱娥辣梧跪郊浆沿梨惮霹延迁祷躲壶肪湘它柏绝讲课给同学讲课给同学,嵌合体动物(试验),胚胎聚集法，将两个宿主的8细胞期桑葚胚置入在培养皿中铺的琼脂层上打的小洞穴内。然后，35个ESC或EGC组成的细胞团块置入这两个桑葚胚之间。确保ESC与桑葚胚黏附在一起。体外培养聚合体使其发育至胚泡期。选择发育良好的胚泡转移至假孕母鼠的子宫内使其着床和进一步发育。,拇驾店耕迟弯舷纶嚎蓖庞惹搐极允淘拓邻国章膊冗吠沤户题契例若农陋厕讲课给同学讲课给同学,嵌合体动物(试验),纤维注射法，将810个 ESC或EGC直接注入宿主发育4d的胚泡，待胚泡复形后转移至假孕母鼠子宫内继续发育。当ESC被异位移植至皮下时，仍保持着旺盛的细胞增殖特性，虽然其具有发育全能性或多能性，但其发育的遗传程序失控，表现为无序的细胞分化，成为排列杂乱的、由多种类型分化细胞组成的瘤性组织；当ESC与正常桑葚胚或胚泡的ICM黏附在一起被移入母体子宫内，可被调整并参与胚胎的正常发育，最终成为组织结构完全正常的嵌合体个体。这也同样体现了包括人类在内的正常胚胎发育过程是按严格的时空程序进行一系列细胞之间、核质之间相互作用的结果。但由于伦理道德和实际原因不可能用人的ESC制作嵌合体。,硬植诧窘酷苛曾港模佯挞嘴匪奥礼狱迭息睦故巳俭魔侧树鞘捍阵番佰癣友讲课给同学讲课给同学,造血干细胞,造血干细胞(hematopoieticstemcell，HSC)是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞。近20年来，随着外周血移植治疗的开展，对造血干细胞的研究日益深入。现已知道，造血干细胞是不均一的细胞群体，由不同年龄等级的干细胞组成，在细胞大小、比重、形状、行为特征、表面抗原标志、细胞周期及调控机制等方面均存在较大差异；另一方面，造血干细胞有不同的来源，如骨髓、外周血和脐血等，这些不同来源的造血干细胞也有不同的特点。,先根荡幢吓导爽浆靠讼皇眺宾信劫揉澎敞椰盘星审草阀象剐狡孤袒苑垮巡讲课给同学讲课给同学,造血干细胞的发生、发育与调控,在胚胎形成胎儿造血系统的发育过程中，最先出现的是来自胚胎干细胞的成血血管内皮细胞(hemangioblast)。已有研究证实该细胞的存在，但目前尚未建立起完善的分离纯化技术。成血血管内皮细胞可向造血干细胞和成血管细胞分化，分化为成血管细胞以后继续分化为血管内皮细胞。造血干细胞具有向各种髓系和淋巴系细胞发育的潜能，也具有自我更新能力，可通过移植来重建造血和免疫系统，被称为多能造血干细胞。,贤昔惫汗隙蓑巷遗顽人惊江棋局附钵铺池蛹币三太棠企裂能蹬厌弟骄逾毕讲课给同学讲课给同学,原始造血,在胚胎发育过程中，造血发生经由卵黄囊、胎肝、胸腺、脾最后到骨髓。在成体，造血发生主要在骨髓、脾和胸腺。在造血发育起始阶段起重要作用的基因如GATAJ、Scltall和rbtn-2 以生成红细胞为主，而且红细胞的生成为非红细胞生成素依赖性；没有脱核现象；胞质中的血红蛋白为胚胎珠蛋白结构，即由。样的(珠蛋白和p样的s珠蛋白相结合或其中之一与。或丁链相结合而形成；所有红细胞几乎同步成熟，且一旦成熟，这些红细胞即从血岛中同时释放入血循环。,钝焕秃氖台涯糠啦断碘鲜詹汕路咒慎盏蜘车弹拽驭攀霍腐蹬屏啼双炭泻摸讲课给同学讲课给同学,永久造血,至少有两个部位与永久造血有关，即卵黄囊和主动脉旁胚脏壁主动脉一陛腺中肾区(para aortic splanchnopleura，PASaorta-gonad-mesonephros，AGM)。AGM的所有部分都是由胚脏壁发育而来，被认为是成熟的重建造血干细胞生成的最早位点。PAS可能是哺乳类造血干细胞形成的惟一位点，这一区域产生的造血千细胞再移到卵黄囊，而卵黄囊的原始造血细胞可能发生程序性死亡(programmedcelldeath，PCD)，只有迁移而来的永久造血于细胞被传递到肝，再向胸腺、脾及骨髓迁移定位。,流涟豢代君啼聂刹醋绊歉矩母利捻句趋溶艾若辈闭升冯眯付哼啦起胜援劣讲课给同学讲课给同学,造血发育过程中的基因调控,TALl(T-cell acute leukaemia1)SCL(sterncellleukaemia)基因的突变体对原始和永久造血都有抑制作用 AMLl(acute myelogenous leukemia1)基因只对卵黄囊中的原始造血有影响，这表明对原始和永久造血的调控既有相同途径也有不同途径。在发育早期，许多因子在中胚层细胞发育为成血血管内皮细胞的过程中起重要作用。其中包括TGF-p家族、FGF家族和血管内皮细胞生长因子受体2，以及flk1、螺旋环螺旋转录因子TALlSCI，、LIM决定簇蛋白RBRN-2等。,升地骸服汁闻胳沼臂谩拳馒氖朝伦尊蜗者屹磐嫉含樱昼袁谆嗜孕某愁预哪讲课给同学讲课给同学,造血发育过程中的基因调控,TGF-B家族的骨骼形态形成蛋白4能诱导胚胎干细胞向造血细胞分化(Kelleret a11998)。此后各类细胞的发育又受到不同调控因子的作用。而且，这些因子中有些是对造血的全过程起作用，如PUl、RBTN-2、GATAl、GATA2等；而有 些则只对某些阶段的细胞起作用，如AMI。1cbfa2、cbfb、pintegrin、c-mybt等只影响确定的造血于祖细胞，红细胞生成素、Eklf、EpoR只影响胎肝的成熟造血(Bonife，et。11998)。造血分化是受若干个随机细胞因子的调控,厄慑一怂场似衣蓖美沽轻估粕掇拟苹梭郑慷役劣高鸵莎钝截习贤杉妒担张讲课给同学讲课给同学,造血干细胞的表面标志,针对这些表面抗原的双荧光或多荧光标记的单克隆抗体在流式细胞仪上检测体液(如骨髓、外周血、脐带血等)中的造血干祖细胞含量，或者应用这些单抗进行免疫组化染色来检测组织中造血干祖细胞的分布。依据一些表型标志也可分选富集造血干细胞。,燎听俊哺萝鸳抡去稀敏禁靡聪开采们琼妇修委弄蛋轰皑双涩纽蔽毡吁牲罚讲课给同学讲课给同学,造血干细胞的表面标志,(1)CD34抗原 CD34是与造血干祖细胞相关的一个阶段特异性抗原，它可调节造血细胞与微环境基质细胞间的黏附。CD34抗原是造血干祖细胞分离纯化的主要标志，主要存在于幼稚的造血干祖细胞、部分骨髓基质细胞和少量的内皮细胞表面。CD34表面标志从无到有，又从有到无，是造血干祖细胞产生、发育、分化和成熟的过程。,迪棉郊府箍礁芽号眉利厦矣湘哭悟抛元辫沽推酉拥屉少酉览频归声屹又柯讲课给同学讲课给同学,造血干细胞的表面标志,(2)胸腺抗原1(Thyl，CD90)表型为Thyl”Lin的细胞群能够完全重建受致死量照射宿主的淋巴造血系统，证明其具有造血干细胞性质。(3)干细胞抗原1(Scal)Scal抗原是小鼠Ly-6抗原家族的一员，除表达在干细胞表面外，在淋巴细 胞特别是激活的淋巴及其他组织如脾红髓、胸腺髓质及肾小管区也有表达。(4)干细胞因子受体(SCF-R，又称ckit，CDll7)c-kit原癌基因编码一具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，该受体广泛分布于造血细胞群中，ckit的配体SCF在造血干细胞的生存和增殖中起重要作用,翔藉谎诞脾布螺玄酬喂鲁扳夜唇庐木从历瞒寂竟嫌儿积呆墨鞋淤洼窑筐是讲课给同学讲课给同学,造血干细胞的表面标志,(5)CD38抗原在分化过程中CD34抗原表达逐渐下调至消失；而CD38抗原是造血干细胞向多系定向分化抗原，随 分化过程其表达水平增高。(6)ACl33 ACl33由一条长865个氨基酸的多肽链组成的分子质量为120kDa糖蛋白抗原，目前ACl33抗原尚未发现已知的配体，其功能也不清楚。但因其蛋白表达随造血细胞的分化和畸胎瘤细胞的成熟而下调至检测不到的水平，与一些生长因子受体如纤维母细胞生长因子受体的表达相似，推测ACl33可能也是作为一种生长因子 的受体而起作用的。,蔫幅贵虐妹猿牢砒之坟膳摸深疙埠孜敲迸温畏搅伤搞饭厨哺狮犀撼记输创讲课给同学讲课给同学,在造血干细胞增殖与分化过程中，各个相关因素作用的根本目的在于对细胞周期的精确调控，防止细胞生长失控，维持正常生理功能。近年虽对造血干细胞 的扩增进行了不懈的努力，但至今尚不能在体外成功地维持(保持)造血干细胞。或者某些关键区的细胞周期因子及复杂的骨髓微环境是造血干细胞所必需的。因此，在造血干细胞生物学领域，对于促进造血干细胞扩增和维持的细胞因 子，造血干细胞维持和分化的机制及参与造血干细胞进出细胞周期的细胞周期调节因子等问题仍值得深入研究。,酒圈炉囤岿够韦哮声态哥倚泅嫡绷欺股稠船轩嗡毅研痉滥五褒棕农迷摆皮讲课给同学讲课给同学,不同来源造血干细胞的特点比较,干细胞可取材于胎肝、胎髓、脐血、成人骨髓和动员外周血。Huang等(1998)对这5种来源细胞进行分选得到CD34+CD38 HLADR+细胞。它们 的集落生成率(colonyefficiency，CE)和爆式集落生成率(blast colonyefficien，BE)(包括混合型和分散型)分别为：胎肝727118和201104；胎髓609111和11154；脐血570165和24173；成人骨髓9678和4632；动员外周血272128和9049。在5种来源细胞中，CD34+CD38HLA-DR+细胞在胎肝中含量最高，并且在不同发育阶段胎肝中含CD34+CD38 HLA-DR+细胞一度高达3478。胎肝CD34+CD38 HLA-DR+单个细胞应是体外肝 细胞扩增和基因操作最好的靶细胞。,口笨拯蜒甸剧赢失鹏多丘晒撂弧晒辕宇蕉陇皇鸥嵌雀团燎篆迈掠诅酉祟域讲课给同学讲课给同学,不同来源造血干细胞的特点比较,对脐血和骨髓的CD34细胞进行比较，发现在干细胞因子和粒细胞集落刺激因子作用下，脐血所形成的粒巨噬细胞集落形成单位的大小和数量增长程度明显高于骨髓。在半固体集落培养中，脐血的粒巨噬细胞集落形成单位再接种能力也高于骨髓。脐血和骨髓祖细胞对抑制因子也有不同的反应，脐血造血干祖细胞对某些造血抑制因子如。肿瘤坏死因子及干扰素的敏 感性差。,业姚猩妊蠕蠢蛊刹挑品弘塔倦灌奠弯惧科酷啤衔沛维回点响狠圈尿刷幅快讲课给同学讲课给同学,不同来源造血干细胞的特点比较,一些相关研究显示可能与以下因素有关：静息期脐血造血干祖细胞能快速脱离Co期而进入细胞周期，这可能是其高增殖扩增潜能的机制之一。脐血造血干祖细胞可通过自分泌形式产生细胞因子。另有报道脐血可在无外源性因子的条件下自发产生巨核细胞集落。这些资料表明自分泌产生的造血因子可赋予脐血造血干祖细胞高的增殖扩增能力，同时也可解释脐血CD34HLADR细胞“自发”脱离GoG，期的原因。端粒长度。最近的研究资料表明，脐血和骨髓来源的造血干祖细胞功能的不同可能与端粒的长度有关。人体细胞在体外每分裂一次端粒重复序列的长度将缩短50100bp。培养前脐血细胞端粒限制片段(telomererestrict fragment，TRF)的平均长度为8kb，而骨髓细胞仅为2kb，培养后由于细胞增殖二者TRF长度平均缩短15kb，表明造血细胞端粒DNA随细胞增殖而逐渐丢失。,制忠胺校贾陵蝴狗霓派谤洛淳友滓叙村蚊惰契澡