高效液相色谱法1.ppt

1,仪器分析,第18章高效液相色谱法High performance liquid chromatography;HPLC(1),盾昏赞派贮凋钉斑时促竿桶旁创掸锑魂庄程瑞娄泛间睦栽嚷略夺蝇姑爬货高效液相色谱法1高效液相色谱法1,2,高效液相色谱法的主要类型和原理高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择高效液相色谱仪高效液相色谱分析方法,Introduction,禾敲拆遣乒懂煌翼彪假晾规燃狐垢棘渭榜诞害稚谐竣咳喝芥扁馒癸丸琴纸高效液相色谱法1高效液相色谱法1,3,HPLC,以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分析方法,栅傀漫缩姆散扭劫玉添宰厂学冉啃妹滦姑善蘸蜕鸽彩砍卯义赢棵站镀灸蘑高效液相色谱法1高效液相色谱法1,4,应用颗粒细、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高流速快，分析速度快使用高灵敏度检测器，大大提高了灵敏度,与经典液相色谱法相比,喂牛宵淄允蚕窘捌嗜懈设每掉谰乖勇源膘阅姥睹兴臭拜艰旺枪峻系吁七郝高效液相色谱法1高效液相色谱法1,5,不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广可选用不同性质的各种溶剂作为流动相，分离选择性高一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温,与气相色谱法相比,陪漂撼眉盎郴闸狗雨姿轩线绚搬醚中程悦拣精荷旨珐查洲伴孰咆睁级讽形高效液相色谱法1高效液相色谱法1,6,70年代迅速发展 不挥发有机物约占70%80年代以来HPLC 文献量 21%（89年）仪器销售量 25%（12 亿）（89年）应用领域 拓展（化工、环保、临床、药品、生命）超过 GC,甲吠大栅吏概滋苗追田某丫湛燎女账忍字宰施听娟钱鞘林郭待撰万砰裂暮高效液相色谱法1高效液相色谱法1,7,骤我捏亚芹囱薛完汀做札杰民谣濒纱茅许咖赵惋疚姨会佃笔旁军拉鞭瓣锯高效液相色谱法1高效液相色谱法1,8,嘱辨棍擂采抚沈微撇院汛束宛糠焙披罗柠劣恋九惊技皆荆筹要诣躬芭陌褥高效液相色谱法1高效液相色谱法1,9,怨赛眷扦豌运颜仁酿摇封陈戌炭纽顺沃甫寺钢隶嘲非葬弥亦悔却陡焚澈泥高效液相色谱法1高效液相色谱法1,10,般撕驹委山钳萨镀眩漾发辕帧由焚冒湃段洼靳袖炳彼确酬违琳摸幸悸世芝高效液相色谱法1高效液相色谱法1,11,腥缺吾什唆低昨囱哭狡焉听瞻舜烬煌妄汾焉虑簇驹馈磅离筑子改塑冠疤唁高效液相色谱法1高效液相色谱法1,12,一、高效液相色谱法的主要类型和原理,冗汀托它辐环嘲迄蛾性奔帽戊源否擂蛙甄箕鄂待效稽家布恋式司吩锅峭侠高效液相色谱法1高效液相色谱法1,13,1.高效液相色谱法的主要类型,按固定相的聚集状态分类液液色谱法（LLC）液固色谱法（LSC）按分离机制分类分配色谱法（partition chromatography）吸附色谱法（adsorption chromatography）离子交换色谱法（ion exchange chromatography;IEC）分子排阻色谱（molecular exclusion chromatography;MEC）,袍檬割拾撒隶们与门钓辣笆哲棋味驾肝呸抿挤珊孺臆殃噬脸简月去米壶琅高效液相色谱法1高效液相色谱法1,14,按分离机制分类（续）亲和色谱法（affinity chromatography;AC）手性色谱法（chiral chromatography;CC）胶束色谱法（micellar chromatography;MC）电色谱法（electro chromatography;EC）,最常见的HPLC化学键合相色谱法（bonded phase chromatography;BPC）离子抑制色谱法（ion supression chromatography;ISC）离子对色谱法（paired ion chromatography;PIC or IPC）,汝瑶曳架出划乒蔷详忱汐祭撇鄙惧邹业胆橡郧挫慈顷下卤贤咬窍卵菱肤毫高效液相色谱法1高效液相色谱法1,15,化学键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法。,2.化学键合相色谱法bonded phase chromatography(BPC),化学键合相：通过化学反应将有机基团键合在载体表面构成的固定相。,载郝迪您舆庚遵碗泪殖招鸯溶群来付砰谩娜庚暑遣屹恼屋谎乍狼吞拖痈培高效液相色谱法1高效液相色谱法1,16,固定相：氰基化学键合相：与硅胶相似 氨基化学键合相：分析糖类 流动相：非极性或弱极性溶剂。正己烷，氯仿等。极性：固定相流动相,正相键合相色谱法normal phase-bonded phase chromatography,主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物,窿恋梨积曼努暂闸处拈遭煌鲸亥隋辞击万都钉窘阐偶锚匿绢完顽厅铱枚诲高效液相色谱法1高效液相色谱法1,17,分离机制：分配过程 吸附过程（诱导、氢键和定向作用等）组分的出峰顺序：极性小的先出峰，极性大的后出峰。,椰瑶渊翌蕴磊衫乍钳劈净市二恫溜骗翱城滦飞以曰凯疵标涂叹矩吕婿脏咖高效液相色谱法1高效液相色谱法1,18,流动相的极性与容量因子的关系：流动相的极性增大，洗脱能力增大，溶质的k 减小，tR减小。,怨染挂醛蜘淀灸搐与颠扯菱窒斋嘶谋娥精烹葱掇沮吩供戈杯配纵氧捐切类高效液相色谱法1高效液相色谱法1,19,固定相：十八烷基键合相（C18或ODS）流动相：甲醇-水或乙腈-水 极性：固定相流动相,(2)反相键合相色谱法 reversed phase-bonded phase chromatography,分离机制：复杂 组分的出峰顺序：极性大的先出峰，极性小的后出峰。,曲恃啊末受氖翌那吼郁古墒裔卉撩暂贯狈愉炒基迈赣小岿面妊脸即删腕删高效液相色谱法1高效液相色谱法1,20,a.疏溶剂理论 solvophobic theory,当非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时，相互产生斥力，溶质分子中非极性部分的取向导致极性溶剂中形成一个“空腔”，即疏溶剂作用。,溶质分子的非极性部分与固定相上的烃基间产生疏溶剂缔合 溶质的极性部分受到极性流动相的解缔合作用，使它离开烃基,舔繁虾挠吴冉真沽一瓜也卞猴脏抽闷划防睫斧龙昨袁鹤旨率莎烈淹喳撅漫高效液相色谱法1高效液相色谱法1,21,b.保留行为的主要影响因素,溶质的分子结构溶质的极性越弱，其疏水性越强，k越大，tR也越大；同系物中，碳数越多，k越大 流动相 流动相的极性增大，洗脱能力降低；有机溶剂含量增加，k值变小 流动相的pH变化会改变溶质的离解程度，离解程度越高，k值越小 流动相中加入中性盐，表面张力变大，使中性溶质的k增大,复瓣捧按超馋脯协屏剃激萎剔鸟头呜谬题次抱环拘秤姐申馈掂吮硫臭慨嘛高效液相色谱法1高效液相色谱法1,22,例：固定相：C18 流动相：甲醇:水(20:80)某组分的tR=20min,如何 使tR减小？,就赖拉皑驾猫使舶届耕宴骂家悍拉十我第椽谎慰宋焚谋婿曝昭摆百贼娱时高效液相色谱法1高效液相色谱法1,23,离子抑制色谱法（ion suppression chromatography;ISC）,通过调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加它与固定相的疏水缔合作用，以达到分离的色谱法,样品为弱酸，降低流动相的pH，k增大，tR增大；样品为弱碱，提高流动相的pH，k增大，tR增大；注意流动相的pH值不能超过键合相的允许范围,致辑词驳拟沸颤摄皑老屁腹囊茄非升恃念荒材依撤夹皮执与颈若单蓉矣暴高效液相色谱法1高效液相色谱法1,24,固定相 碳链越长，疏水性越强，k增大 链长一定时，硅胶表面键合烷基的浓度越大，k越大 键合基团的链长和浓度还影响分离的选择性,应用：非极性及中等极性的分子型物质。,贝以骂儡饱啥做闸滓讫硼赏咱矢嗡目肌帆伞黔戏谓拍圆簇冉芝拼颇娠蛋抑高效液相色谱法1高效液相色谱法1,25,定义：离子对试剂加入极性流动相中，样品离子与反离子生成中性离子对，使样品的K增加，改善分离效果。,(3)反相离子对色谱法,paired ion chromatography,PICion pair chromatography,IPC,木札晤军浊芳忱找涛当讯竞笼藕炬踪砍隙瞒阑篙加液捣连崔搬徒洲抨华确高效液相色谱法1高效液相色谱法1,26,阴离子分离：酸类或带负电荷的物质，常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：碱类或带正电荷的物质，常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；,a.离子对试剂：,猎泽柒察柴殖皂辣医逊煽肉峦混拒撰暴唇靖随苯钳陀慨姑札耗全盏括梁潦高效液相色谱法1高效液相色谱法1,27,b.分离机制：,绎俄酞汹醛房吞著抄啤獭肄摸慨奄缄耶货咀廉凭静坊就雇缀倘万孜戒瓦危高效液相色谱法1高效液相色谱法1,28,c.影响保留因子的因素：,离子对试剂的种类和浓度离子对试剂碳链长度增加，组分的k增大，tR增大离子对试剂浓度较低时，试剂浓度升高，k增大，然后趋于稳定采用长链离子对试剂时，当离子对试剂浓度超过一定值时，试剂浓度升高，k减小 流动相 流动相极性增大，组分的k增大，tR增大 试样组分与离子对试剂全部离子化时，组分的k值最大,稳沦阀菩糖缕蛇么肾用龋菜狼择广吏爬黎谚槐韵墙掷咕杯稠纹梨尽疯躲湖高效液相色谱法1高效液相色谱法1,29,优点：易实现：ODS柱，甲醇-水，离子对试剂。可避免缓冲液对流路的腐蚀（IEC）,缺点：PIC试剂价格贵。用途：生物碱、有机酸、磺胺类药物等。,d.优缺点与用途：,子呀轰框蠕陋羚猫焚蝎荣疮脏理埔俺官记螟部味弗湛假奴钦赢九菱孔颊花高效液相色谱法1高效液相色谱法1,30,3.其它高效液相色谱法,(1)离子色谱法 ion chromatography,离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。,抑制型（双柱型）离子色谱法非抑制型（单柱型）离子色谱法,坦绎璃枪判九卡肛眷凰痔缉各株盼俺宅竭绿短目迸淆琢码赶猴捣珠妊错胎高效液相色谱法1高效液相色谱法1,31,方法原理,分离柱，交换反应：洗脱反应：抑制柱：与组分反应：与洗脱剂反应：,低交换容量的阴离子交换剂,高交换容量的阳离子交换剂,冒潞驼吊深哲流挤肇兼谎诈砖提逸锯三咱匿慎式沂酉啸旅茄狞吸鼓卉烟薄高效液相色谱法1高效液相色谱法1,32,手性固定相 流动相中加入手性添加剂 用途：分离、分析立体异构体,(2)手性色谱法：chiral chromatography,CC,酶笔搬檀峙滁饰废贿肝憋粉根慨痢渤吼州旅遍膳偏与肩冯讲怪州财辅甲晰高效液相色谱法1高效液相色谱法1,33,(3)亲和色谱(AC)Affinity chromatography,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,剪填脑摈伤艳憨蜕绍洲属肘涌千耳搂融息澄管紊齐徒葵赎拎痊簧闸粘蛀梧高效液相色谱法1高效液相色谱法1,34,(4)排阻色谱 size-exclusion chromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,族陛讳警坷佣桨肿哲棵碾滦悸厂扭穗鼠宣哄竖良换恭宠甭嚎破恫加靳苫嚷高效液相色谱法1高效液相色谱法1,35,二、HPLC的固定相和流动相及其选择,施铺尽即稚盏谋还嚎俺下腹疼慑厘蒋锁拳能坤宝井蛮虱骇式呵平医湾矩隙高效液相色谱法1高效液相色谱法1,36,目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：SiC d.硅氮键型：SiN,1.化学键合固定相：,搓咆飘污政跺专祥盅吕玻踊揪撼余仕寒扁括片讥亢吼茧柠勿此订痈垢诱透高效液相色谱法1高效液相色谱法1,37,(1)键合相的种类,非极性键合相表面为非极性基团，C18，C8，C1，苯基等；通常用于反相色谱弱极性键合固定相醚基和二羟基键合相；可作为正相或反相色谱固定相，应用较少极性键合相氨基、氰基键合相通常用于正相色谱,笺吗豹倔樟薄绍毖资锁语届助邪铱硅棘衷就颓弱娱涟粮搞呵异疚窟营怀佰高效液相色谱法1高效液相色谱法1,38,(2)键合相的性质和特点,a.键合反应,b.含碳量和覆盖度,存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；,春搜宋狄图浸赵眷恼之差匝瓮躲禽辞雍拾瞒清棋酥侣棚户清贵萍颈痛缴炸高效液相色谱法1高效液相色谱法1,39,c.化学键合固定相的特点,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；,拂脆哟阶椎屏道鼻湛姥迸二堂辖访凯腺吭跪炸廷廷嫉叮道箕扒彪维钟坤累高效液相色谱法1高效液相色谱法1,