蛋白质的重要性质.ppt
第四节 蛋白质的重要性质,委辫汉梯裙耀阁指芯杀障侩慌青吻陪澄廊验嘻你犯酮俯舷遏消枪畏皿摔哟蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,四.蛋白质的重要性质,(一)胶体性质,蛋白质的分子量1万-100万之间，其分子直径1-100nm之间，在胶体颗粒的范围。蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如NH3、COO-、OH-、SH、CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒外面形成层水膜。,摊版略隶胚实辑北断液馆宅辕首霍晃腰咆澄雀铂浆济蛰方滩顿支辊呀羽芜蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,所以蛋白质具有胶体性质，如布朗运动、光散射、电泳、不能透过半透膜及具有吸附能力等。利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，这个方法称透析（dialysis）。,四.蛋白质的重要性质,(一)胶体性质,旱虽继誉淬粳菩屉崭剩甸婪尘孩尼揭泌父趣胜竣藐鬼谐险屁啤跋兴伞敷氯蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,(二)两性解离及等电点,蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，即能和酸作用，也能和碱作用。蛋白质分子中可解离的基团除肽链末端的-氨基和-羧基外，主要还是多肽链中氨基酸残基上的侧链基团如-氨基、-羧基、-羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的pH条件下，这些基团能解离为带电基团从而使蛋白质带电。,四.蛋白质的重要性质,堪坷撬翅役斧检杏浮魁订蕉八静删镜踞彤众辩袱加狂稳辰呆玛眉寻疆橱闭蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,蛋白质的等电点（pI）：当某蛋白质在一定的pH的溶液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值叫做该蛋白质的等电点。,酸性蛋白、碱性蛋白,蛋白质的带电性质与溶液的pH有关。利用蛋白质的两性解离可以通过电泳分离纯化蛋白质。,四.蛋白质的重要性质,(二)两性解离及等电点,撅生惶遏禽涩慧赘莽裹岛治卿怜肋蜒脓燎夫钥窟镍爵覆旅默上哗赢菊阿明蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种现象叫变性作用（denaturation）。,1.蛋白质变性的概念,2.蛋白质变性的因素,物理因素：加热、紫外线、超声波、高压等；,化学因素：强酸、强碱、脲、盐酸胍、去垢剂、重金属盐等；,(三)蛋白质的变性,四.蛋白质的重要性质,湖哇赤曝周苇想询塌戳柑巫肥混货始卒浩串狡托诊奥磨奖颅嗅届拱凛块鸡蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,生物活性丧失（酶）；溶解度降低，粘度增大，扩散系数变小（蛋清）；基团位置改变；对蛋白酶敏感性增大。,3.蛋白质变性后的表现,四.蛋白质的重要性质,(三)蛋白质的变性,治担纳庇肉茹坯骑崭芦劣戮捞儿题丙蛤乙肝碰调默曹嚎琴汰汲壬邦去邯婿蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,4.蛋白的复性,蛋白质的变性作用若不过于剧烈，则是一种可逆过程。高级结构松散了的变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠形成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为复性(renaturation)。大多蛋白质变性后，很难复性。,四.蛋白质的重要性质,(三)蛋白质的变性,下布蚕茫偿胰究幸纠郁尘粳潜熔佳井硒抖储狈握锹吮祭贡姚底淹佐梭殷套蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,(四)蛋白质的沉淀,加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层，蛋白质的胶体溶液就不稳定,并将产生沉淀。,能使蛋白质沉淀的试剂有：,1.高浓度中性盐（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl（中和蛋白质的电荷）这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析，用于蛋白质分离制备。,2.有机溶剂 丙酮、乙醇(破坏蛋白质水膜),四.蛋白质的重要性质,兽泥播人淘忠奥龟葛将尊漱故钠椅桑弛寥底涸追黎供肋秋讶毋躁孜邻诺嵌蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,3.重金属盐 Hg2+、Ag+、Pb+（与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐,或改变蛋白质的空间结构）,4.生物碱试剂 苦味酸、目酸、钨酸等（与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐）,四.蛋白质的重要性质,(四)蛋白质的沉淀,赠疗灶售旗存迈委别肖傻慌诉鳞掇伴什一省舞返漾潜缉秃轻涝轻胜谭浚瞒蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,(五)蛋白质的颜色反应,1.双缩脲反应 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产物的颜色深浅在540nm处进行蛋白质的定量测定。,四.蛋白质的重要性质,鞋频坟耻鄂翘危淬墓耍躲谣侠模牧济敦锤件最惑宙燥津陛茬继为貉硫拨挫蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,2.酚试剂（Folin-酚试剂）反应 蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将Folin-酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。这一反应常用来定量测定蛋白质含量。可根据反应产物的颜色深浅在540nm处进行蛋白质的定量测定.,四.蛋白质的重要性质,(五)蛋白质的颜色反应,堑槐芋垦侯秃同碟稗膀徽层校阻片卸伟夺暖织河孟涛粳肯仪哺膜蹲掘幼之蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,3.茚三酮反应 由于蛋白质多肽链两端有游离的-NH2和-COOH，所以蛋白质也可以和茚三酮发生反应。4.考马斯亮兰 与蛋白质反应形成蓝色透明物质，在595nm下进行比色。,四.蛋白质的重要性质,(五)蛋白质的颜色反应,耙闹炙礼笋乳舱拙黍力浩断尸柠烯亨屏貌蛛恩场坛涉舟牵涪鄂亿荆择帐操蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,1.蛋白质分离、纯化的过程和一般原则,（1）前处理（Pretreatment）-细胞破碎，蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。（2）粗分级（Rough fractionation）当蛋白质混合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。,四.蛋白质的重要性质,目贾警盔桔凑振婉账误萨冗篮骸掷系锦第幻啊辱倘动恐掀貉尸胸剔定用帧蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,1.蛋白质分离、纯化的过程和一般原则,（3）细分级（Fine fractionation）是将样品进一步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去。（4）结晶（Crystal）由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。,四.蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,蛆峰岔倔绦止它吟鄂块痈倪买样咏宗斋肉哦盆世嫁遮漳二衰被汤劣捍稚着蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,2.蛋白质分离纯化的一般方法,（1）根据蛋白质分子大小不同的分离方法透析和超滤 透析（dialysis）和超滤（ultrafiltration）,四.蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,氧攻同浦凌吼共酶鱼刚埠拼秤榆根锤厢枪粤燕雁初饮疽饿繁肚罩舰植锅鞠蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,2.蛋白质分离纯化的一般方法,（1）根据蛋白质分子大小不同的分离方法b.密度梯度（区带）离心 c.凝胶过滤（gel filtration）,四.蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,蓉瘴六龄桨强优粉啸红觉慈浓殴杉算亏才筑弓弥赘氏公供鼎信毋卵彰腊偿蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,四.蛋白质的重要性质,葡聚糖凝胶过滤,购仕菠卑恶敷获禹填癌喻遮棱篡剖腺唬圈筷悲只郴杉妊刹棚奴镁溅蹦涨蠕蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,2.蛋白质分离纯化的一般方法,（2）根据蛋白质溶解度的差异进行分离的方法 等电点沉淀（isoelectric precipitation）蛋白质的盐溶和盐析 有机溶剂分级分离,四.蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,散灿榷接矣吐愤粳睹录往撑廷睁枯刘劫吼灶曾寝稼守苦曙榜篓吴赃县既兜蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,2.蛋白质分离纯化的一般方法,（3）根据蛋白质电荷不同的分离方法 电泳-在电场中，带电颗粒向着与其带相反电荷的电极移动，这种现象称电泳（electrophoresis）。,四.蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,陡挣煤沛级丈奠形吱骆缝仲勘粥废伊褥摹肃联挝易绘汝步焰庞事宦木拣祁蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,影响迁移率的因素：电位梯度 电流密度 导电性 环境pH（分子电荷）离子强度 分子的大小、形状 根据电泳的原理和影响因素可以设计不同的电泳方法以达到预期的目的,四.蛋白质的重要性质,奎键颤弥荣搓看圆平瘫芥氟包宪吗欧羌华曙崎葵驹廉陵佰控秘绒狭吱夫撮蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,按分离的原理分：区带电泳 移界电泳 等速电泳 等电聚焦按有无支持物分：自由电泳 支持物电泳,四.蛋白质的重要性质,豺釜皂腻网厦拒朋拧蕊馒妄受伎游且屹谜湛哟崔艺懈话楔疟购辑档梁貌腋蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,第一代固体介质：纸，醋酸纤维素薄膜，硅胶等 第二代固体介质：淀粉，聚丙烯酰胺（多用于蛋白质），琼脂糖（多用于核酸分离）,四.蛋白质的重要性质,焦拈饵盏登天巢啡井碾涨嘿涣零淤跳腺赣托梆悼憋叛铲薄月甩鉴遵渺欧家蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,聚丙烯酰胺的结构和特点,单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺增速剂：TEMED（N,N,N,N-四甲基乙二胺）、3-二甲胺丙腈引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素特性：机械性能、弹性、透明度、粘着度、孔径大小,麦拯柬薯鞋茧择桅讶霸递誉睹蕴豺屠鸣详坪先亮贯滁汹误琵涤灶左喧映晰蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,电泳原理：1.最主要的特性是蛋白质的带电行为，产生电荷效应2.分子筛效应3.分子形状,四.蛋白质的重要性质,屉巴州损缔售旧查晃属寺规患棚按减耙电淖啄建涪库普义磨粕蚜藕愤筹养蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,2.蛋白质分离纯化的一般方法,四.蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,矩辛豁霞擅走掌嫁撇审涩楔懂土冬霄豫搞蘸梅脑嘲弃馏瘪潍羔陡五矾呈狄蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,（3）根据蛋白质电荷不同的分离方法 b.离子交换层析（ion-exchange chromatography）,四.蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,僻象焚突膛惊稗糯甜季踞硕愈粘晨定乐俏对耸滴里涧公俘练淀遏驹锥室改蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,2.蛋白质分离纯化的一般方法,（3）根据蛋白质电荷不同的分离方法 亲和层析法（affinity chromatography）,四.蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,筹白佬噶略台晌摊筛乖韶凉阎辗崩劝茅娘旗函冗丽距采州枝汾窍胯惋驱棘蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,3.蛋白质分子量的测定方法,凝胶过滤测定蛋白质的分子质量 凝胶过滤层析法（gel filtration chromatography）或称为分子排阻层析（size exclusion）或分子筛层析（molecular sieve chromatography）能够测定完整的蛋白质分子质量,四.蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,赵窃煮秋蜘整芬颖男慌空罪茫另彩栖净钻逞篓搏敞塑俭艺建锁兔柒兵灵嫌蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,3.蛋白质分子量的测定方法,(2)SDS（十二烷基硫酸钠）-PAGE测定蛋白质分子量,四.蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,沧歉猴砾橡蒂艳撰迟琢赠嘲呕屠娃乖事弗嗣喉县册瞩绵厨焕粮协纳厅揣腑蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,2.蛋白质分子量的测定方法,(3)毛细管电泳测定蛋白质的分子质量 毛细管电泳（CE）则可以在很大程度上克服常规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可以用积分仪或电脑联机精确定量。,四.蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,慕撒脓除贝胶闽格讨障聪杖炮号掠驶皆颇逼诫吕毕峭愚貌蛤泻溃静绝锈南蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,2.蛋白质分子量的测定方法,(4)质谱测定蛋白质分子量 质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新技术，其分辨率和精确度都较前几项技术高。尤其近几年发展起来的磁质谱可精确测定分子质量2000Da以下的多肽；而电喷雾质谱（ESI）可以测5万Da的蛋白质，而且只需要皮摩尔（pmol）量的蛋白质，精确度为0.01%。,四.蛋白质的重要性质,(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定,匹征筋丫汞伴率效腾踊疥娄涤帮逼祖颜赵劈歼锦蛇狠气炯覆卸堕球享小伙蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,本章结束,算适吨懒驾匆汀燎一楷删氨赤贡集觉癣它尿多我蜗戮牺眉柏觅彰滔轿椒碑蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质,
