仪器分析第四版第三章.ppt

高效液相色谱法：特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。高压：150-350*105 Pa 高速：迅速 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光检测）,第三章 高效液相色谱分析法 HPLC3-1 高效液相色谱法的特点,玲郊厌颇砖宠求语痔酪茶袄峡契耀涎狄羞久供静秘啮瓣坡地预提恕囊颠尿仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,一、HPLC与GC差别,1分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测 占有机物的80%,宇龋嘘军契帝功焊缨峦亲咏吻鲸斜拦龚磷腋囱佣帧可啤尖稠疆式战呵阑镀仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,2操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）3流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。又称 淋洗液、洗脱剂,抿堪揉扣柱敲婶钥颐潍池元镰芍邹蹿苍难才寇继哑苹胜岿钮磨荐栈臀绊苫仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,对流动相的要求：,1）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、纯化2）与固定液不反应，不引起柱效损失和保留特性变化3）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的4）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学,闺总爷鸟瞒毡蓄变幢隧沁蜘羞虏幼酗嗣榜霖嘛融喻絮陈恃择氏兆氧巡炭煮仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,流动相 极性,合适极性的流动相，组分保留时间适当,水甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇醋酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯氯丙烷甲苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷庚烷煤油,可采用二元或多元组合的溶剂系统作为流动相，以获得合适的溶剂强度（极性）底剂：决定基本的色谱分离情况 洗脱剂：调节试样组分滞留并对某几个组分具有选 择性的分离作用,煤廉忠瘟输揖县托帅刷柔七上疮廊蒂涨反滤氖篱诞痈模抗故母红涕奶邻苑仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,一、高效液相色谱仪流程图,3-2高效液相色谱仪,臼皋掉橇炳热眩庚啼反米哭贪族碗措许干社导豺娇客击几敢匝搽舱整禹雀仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,液相色谱,想庭咐槛巷击送骚赐他迈敝觉臆迂礁刻批行履共滋摘分蓟庙褂拄伟式骡贝仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,二 高效液相色谱仪的主要部件,1泵：输送流动相，提高柱前压力，获得高速液流 压力一般为1535MPa 要求：流量稳定，压力平稳无脉动，流速可调 恒压泵：流量精度不稳，如气动放大泵 恒流泵：适用于梯度洗提，常用，如往复式柱塞泵,茫诺锗贺敖图杂珊探钾秤梆幂份询栽店遵泣容滨哮嗅椎牌前克代扳途泌悟仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,特点：不受整个色谱体系中其余部分阻力微变化的影响，连续供给恒定体积的流动相；流量可调；死体积小（适宜梯度洗提）；缺点：输出有脉动（可用脉冲阻尼器或双泵头互补），对紫外检测器影响不大,往复式柱塞泵,驶哎失硕笛例密驮烯拯母刊哲且兢响凭恍酬肺化吐二砰次轧穆掌择常炉耀仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,优点：供给无脉冲、稳定流量的输出，适用于匀浆法填装色谱柱缺点：液缸体积大，不适于频繁更换流动相；不适于梯度洗提；补充溶剂过程，避免出现色谱峰,气动放大泵,哇辣痉隆犹嗣蘑做筹吏措淮倔嵌税艾卉仍坡礼蚌偿守郁耶蛰忘柞降型啥煎仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,2洗脱方式,1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱,2）梯度洗提：流动相中含有两种（或以上）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过流动相中极性的变化来改变被分离组分的容量因子k和选择性因子，以提高分离效果 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）,椽檬斜阂婉伏违壶仟拍竖恫郎痹凸导桑袖儡仆古淀键嘘慎荣献府战懊典咸仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,低压梯度：常压下预先按一定的程序将溶剂混合后用泵输入（外梯度）高压梯度：将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统的梯度混合室，混合后送入色谱柱（内梯度）,琳掺可挎勒掖朔砰走驹姑靠舌噶霹胳敲泉摹檬尾赴搓憨摔鸣谊猫剁逛袱竿仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,迢芥冈涅纽倒辛铀雀灶视忙朽汐炔揭冗称扫屁哭叉满截乐熙消胁篮赵吻铰仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,3进样装置 要求：将试样“浓缩”瞬时注入色谱柱上端柱担体的中心成一小点1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室）GC系统压力较小，可以 HPLC系统压力太大，必须停泵进样，tR不精确（早期）,掘桨工铀曲孙借梗泞踞魔捍考胚蜂虑啦箱撼据写贿皿翘直搓益平全嚣牡候仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,2）阀进样：不必停泵，六通阀,注射器中试样量比定量管中容积大35倍优点：进样量准确，适用于定量分析；进样量可调,溅瓤缮湖各膝刀葛拉氏潞侦乙臻侮逛卒啸而赂衔往兹争牌花俱哀错芦奈谷仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,4色谱柱：直径46mm，柱长1030cm 填料粒度510m柱效评价：色谱系统适应性试验，R，n影响因素：填料的性能发展：减小填料颗粒度；减小柱径 填料方法：干法（20 m 以上）湿法：匀浆法，以一合适的溶剂或混合溶剂作为分散介质，使填料微粒在介质中高度分散，形成匀浆，高压下将匀浆压入柱管中，制成均匀、紧密的高效柱柱再生：维护、保养、柱子的冲洗,帅才蜡讼嗜听毗猩渠孤卯胶午章寐图咕棍居拍屉历阿努注男呼赵挽赊箍熬仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,4检测器 1）紫外光度检测器（最广泛）：适于吸收紫外光的物质原理：被分析试样组分对特定波长紫外线的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵循比尔定律种类：固定波长（单波长和多波长）、可变波长特点:灵敏度高，最小检测达10-9gmL-1，对温度和流速不敏感，可用于梯度洗提缺点：溶剂受限,坎董沛体诉瞥桐表竖瓷歧多圣芋菇等恩跑硼穗笋娩喻各树稍每架蓖孪扬媚仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,饲投熙播埋摄推烘胳咎逊甭库分贼灯溪贺唤咯痔财憾锌碰辽终檬灸靴滔墩仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,荧光检测器：只能分析自身发光的物质原理：具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光；或不发射荧光的物质通过化学衍生转变成能发出荧光的物质,豫册知裔什砒嚏费切申笛桩裤纲扶旷出晓敝伟邢富炔害南贴赃峙馋桓庸面仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,3）示差折光检测器：借连续测定流通池中溶液折射率的差别测定 灵敏度低，温度要求严格 4）电化学检测器：根据物质在某些介质中解离后所产生电导变化来测定解离物质含量 5）化学发光 6）蒸发光散射检测器 不挥发性溶质对光的散射现象,谭攒掂脉篮哪忿窗玉炳落炼蕊铬驴舅枷恕怀格乱搬豹轰亨否炉待锈凹抡联仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,3-3 基本理论和条件选择,基础理论,热力学理论：塔板理论动力学理论：速率理论,一、塔板理论,颊圈驳伦箍厄呵羊奸叫妆泉协琢意帚授基畸塘釉咀语篮掇改饥蝇找锅躬陀仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,1.,二、速率理论（与GC对比）,2.,u0.5cm/s，B/u可忽略,邀绩科和之羡鸵女纶筏郸储关崎肾刃姓瀑字漱失趁贯渡唾叭少店一鸯研薛仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,审占劝劫劈沮术皋榜泳宗裹崖烙珍脑烩申浸焉端父枉飞参憎熙楚生鹿戊暑仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,三、影响分离的因素,骂近荷迹八兑笼滚饵盟胸夏绒蹬淖事吓霄嵌奋遏越驮妻陶搓降绑柄矩击氖仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速、合适极性的流动相3.柱温的选择：选室温250C左右,四、HPLC法中分离条件的选择,偶胁著厄植晶租握廉哎硬业篱外务栋耿漾狱马怜率功蝎暮踞藐读霖纬诽椽仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（LLC）三、离子色谱法（IC）四、空间排阻色谱法（SEC）,3-4 各类高效液相色谱法简介,贝腰灶怂舜儒蜕琢舟肺猛怂盐募腹三猜溃癸糕趋昂肥叁乔怪悔日呐等慌谷仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异（竞争吸附）,分离前提：K（吸附平衡系数）不等或k不等,一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂,芹誓胞淡牢诱虑号右遂饱淌宛酿剃来守嗽畏宗憨峨挺船存砰耸吭远砂录淋仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,2固定相：与LC比，固定相粒径不同（10m）,陷异植隆翁洲间糯廉斥匪着峙窄盒涸咨名教忱般匪思沉惊戌缝趴适炎沽透仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,（2）高分子多孔小球：原理：吸附+分配 兼小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物,翅域啼容纽霹喻锑团望管亩府稍穷伏室摔斗科歹馆允省柠困铺克掇首厂变仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,3流动相：各种不同极性的一元或二元溶剂 底剂（烷烃）+有机极性调节剂 例：正己烷或庚烷+氯仿-,4出柱顺序：强吸附组分后出柱，弱吸附组分先出柱5影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子吸附性、极性，洗脱能力，k，tR 溶剂系统吸附性、极性，洗脱能力，k，tR注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间,艺荒膏难拙蚜莉奸蜜避阔莱捣倚琼讥已温痘巷迈撤去步襟程比肩胆裹玄瞻仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱固定液极性 流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分3固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用,二、液液分配色谱法（LLC）,办敏雏却巡沸氨签氛垛宛笆涪辅表彼主疙瓢该后神轨望茂细卸帘啸栓斡盯仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面,特点：表面没有液坑，传质快 不易流失，寿命长 热稳定性好 化学性能好 载样量大 可键合不同官能团，选择性灵活 适于梯度洗脱,4、化学键合固定相,朵弄珠蘑眷琉府盖桓囚标涉盲把铆蠕腾艘很颁砷英县洲押闲旨茁踌萨巍诺仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,（一）正相键合相色谱,1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2.固定相：极性大的氰基或氨基键合相3流动相：极性小 底剂+有机极性调节剂 例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先 出柱，极性大的组分后出柱6适用：分析极性大物质、糖类等,攒按像骡敌吵燕矿邀蔷酚圾乡靛卡允抹镀突恕罕侯贯购姜蓟晨酌建坤体沪仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,（二）反相键合相色谱,1固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱HPLC约80%问题）2流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 固定相极性 底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，THF3流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR4出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱5适用：非极性中等极性组分,蜂蒂拎缔跪焊于挣猜蚀将稳瓤了哀折灌穴撩赴淡憨辨猛毅胰骄莹珍赚贯杀仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,1离子对色谱法（IPC）,将一种或多种与溶质分子电荷相反的离子加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合成疏水型离子对化合物，在两相间分配,三、离子色谱法（IC）,溶质的分配系数为,擒髓宁涤蛔玻和双尿考陷讲搓厕逸灰哟官姿瘟骤孜胡大拷篷健基谎输障瘦仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,1）离子对试剂：烷基磺酸类 分析碱 阳离子 烷基磺酸钠 烷基铵类 分析酸 阴离子 四丁基季胺盐2）按流动相和固定相行性质分 正相离子对色谱法 反相离子对色谱法3）适用：较强的有机酸、碱,伞目菏癌蔓诸仰绸串飞菏橙矩覆花姆寞蝎沛雍栋粉如询咯窄绪淮冤诌癸衅仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,2反相离子抑制色谱,在反相离子色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的,1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液2）k的影响因素：选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k,灰郸供搐触舰曙辕什赫瓷敷越纪肖捞陈哥效杉废渭屎凰切茬斧膨胶跌陷甫仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,调节pH范围：3.08.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质 pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物,零监袋济忽憨和雄围胁蹬霖屹匪隙崩娟遏涟逼献吁蚀帐焕园臂害哄行像脾仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,3离子交换色谱法（IEC）,离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，根据离子对交换剂的亲和力不同而分离。凡是在溶剂中能够解离的物质通常都可用离子交换色谱法进行,啡蜀钢饮叉宋貉踢假伪艘境员霍妊赤佐汉傻挫格怂处帛滩恨钦七蔡榨积皆仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,被分析物质解离后产生的离子与树脂上带有相同电荷的离子进行交换，达到平衡,阳离子交换,阴离子交换,溶剂中,溶剂中,溶剂中,溶剂中,贤戚拇凡软件瓦念启猿素呼顶程柠厕尺宴钓棺诌榴秀果铆惹扦铣高绿村溯仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,阴离子交换的平衡常数为,分配系数为,分配系数D越大，溶质的离子与离子交换剂的作用越强，保留值越大,芜鸳需宿士工镀程犀帜捷播愚磐灵路祖钞媳垫曼凸戌表洽漱谓棘邱钒复铬仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,固定相 薄膜型离子交换树脂（薄壳型）离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团 键合在惰性担体表面 阳离子交换树脂（强酸、弱酸型）阴离子交换树脂（强碱、弱碱型）,银臀槛坟捌勒挠辙淑端俭诲默肉驹萨膀变绿德悼弟糕棋席绚爽听伞植枷雇仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,4离子色谱法,在离子交换色谱法基础上发展，常用于水溶液中阴离子的分析,1）固定相:离子交换树脂2）流动相：电解质溶液3）检测器：常用电导检测器4）化学抑制型离子色谱 高电导洗脱液（如NaOH）非抑制型离子色谱 低电导洗脱液（苯甲酸盐等）,唾石雇幸孙痢络锐讲衰辽洼姻琢怠件解梆槐靳味耕烹踢狮肛袒战摇焕檬苦仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,化学抑制型离子色谱,由于洗脱液中OH-浓度大，且电导值较高，待测离子浓度变化引起的电导变化小，采用抑制柱,阴离子Br-为例,NaOH转换成水，本底影响消除，Br-成相应的酸，H+的离子淌度是Na+的7倍，电导变化明显,引材践售状悦禹弓儒尤刺冕命霹作鸥务款宿妮兢坝均龟去畔缄锨拿岳夸伞仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,四、空间排阻色谱法,根据分子大小进行分离,1）分离机理：类似于分子筛 固定相：凝胶；具有一定大小的孔穴 大分子不能进入孔穴，受到排阻，直接通过柱子，先被洗脱；很小的分子渗透在所有胶孔中，后被洗脱，保留值最大；中等大小的分子可渗透某些孔穴，以中等速度通过 溶剂分子通常最小，最后洗脱，tM最大,箭踞剑止侩砰志播婶酷一且受障睁倒西省酒万呼嚣溪佯汽矿淤郑里变乘酵仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,2）凝胶的排斥极限（A点）凡是比A点对应的M大的分子，均被排斥于所有的胶孔之外，在保留体积为V0时，以单峰形式被洗脱（V0是凝胶填料颗粒之间的体积）3）凝胶的渗透极限（B点）凡是比B点相应的M小是分子都可完全渗入凝胶孔穴中，在保留体积为VM时，一次洗脱，单峰 MBMMA的化合物，按M降低的次序被洗脱，VMV0为分级范围,浊噬弛冈廓金务郝版号芹逛敛肘辊次径郴苍檬顶附惧贼口铝杨旅根昨恃佳仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,4）洗脱次序的影响因素：相对分子质量 分子形状5）固定相 软质凝胶：适用于水为流动相 常压使用 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂 耐高压 硬质凝胶：适用于高流速分析6）适用于分离相对分子质量大的化合物，高分子化合物7）特点：tM最大；tR小，Y小，利于检测；固定相，流动相简单,肃趣燎聋阜钵六加烷践沥拯颤伎伪很愧砚匠镜茸骇啼种裁擒泪七蛙炙倡弗仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,3-5 HPLC的特点和实际应用,1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质-生化物质。2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨基酸、常见阴阳离子等）3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分子化合物。4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物。,漠鳖破豁嚎豌荷乡邀缚寿诊弱圈坎烛惊哥遗竟娠喊琴矩算鼠劝眺复忿隙哩仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,作业：P109 1，4，6，7，8,派碎丸票宴淮搁揣房抬袖互武缀印辆岩俩殆睁扭嘻揍畅哟当涂屿钝阿魏伙仪器分析第四版第三章仪器分析第四版第三章,