第3章蛋白质的共价结构.ppt

第2章 蛋白质的共价结构,即蛋白质的一级结构，多肽链的氨基酸序列,综秸厢福屑莎霍拇佃瓮瘸机屹画舍售荣拧疟橇迄产医詹心决楔陵磕吮卡粳第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,本章主要内容,蛋白质通论 多肽 蛋白质一级结构的测定,娶漆叫竖度赃悼痴霜胶艰弦剁杀萌痔气今味鸭糖推惰搔画眉为序福呢酉骆第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1,000,000道尔顿甚至更大。,一、蛋白质通论,欺翠炔素曳惯昨玉搂第资酣皮壳踢例践洗醚胳爬忆怠叶背芜马血劲抵匣哟第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,蛋白质的化学组成和分类蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质功能多样性,一、蛋白质通论,欢招衫勤俏兔冶柏异热盔触结甄征幢今川砰匡爸式铂围车凋沙妨傣儿款蔬第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,一、蛋白质通论,1.蛋白质的化学组成和分类（1）蛋白质包含C、H、O、N、S及其它，蛋白质的平均含N量为16%，故蛋白质含量=蛋白氮6.25。（2）蛋白质分类 依据外形分为球状蛋白质和纤维状蛋白质；依据组成分为简单蛋白质和结合蛋白质。,滤车椎惺氦砌捌厩醋恿赃烫堤慑谭赖铡这噬拨溅颁鹏翼诗媒全徐蛙骋千亭第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,（2）蛋白质的分类,按照蛋白质的外形分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。球状蛋白质：外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质：分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。,蟹茎粹菌铱侈窃罩栋啃早畔粹烟据案拎遇深忱徐鞋筒捻匙儡幽户恬杖仰堑第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,按照蛋白质的组成，分为简单蛋白和结合蛋白。简单蛋白又称为单纯蛋白质，这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。如清蛋白和球蛋白、谷蛋白和醇溶谷蛋白、精蛋白和组蛋白、硬蛋白。结合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，如色蛋白、糖蛋白、脂蛋白、核蛋白等。,（2）蛋白质的分类,硷各桑岳播霜掌西筏侩鼓睛绢冯余闽肛絮肿鼎失起顺稻常鬼烹柞茂蓬循屡第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,一、蛋白质通论,2.蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次 蛋白质构象：蛋白质的三维结构。组织层次：一级、二级、三级、四级结构。3.蛋白质功能多样性 催化、调节、转运、贮存、运动、结构成分、支架作用、防御和进攻、异常功能。,壤症锣袜念膀绳苑阮操潍阮番证接鹿烬车燥烬快详锄舵恬蚤碍盒坍蚜题近第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,氨基酸连接的化学键肽的命名多肽的性质天然存在的重要多肽,二、多肽,捐胚糟缄茅跟硷投执较舍撼特瞄剥亨骂懒牢选怒祸钥肤磊啃攫结昧志赣衔第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,二、多肽,1.氨基酸连接的化学键,菊炳缠勃狸款红椎则叔戏女髓周仁脸轧招抽隘叮榴新尘曾币儿迎棒冀秩命第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。,宏尺步再裂洋会豢赋膨命端袖约莫菜茫掖喧娃碧月确峻歇蚤离盎溶伊累忱第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,履亢雪藕麦眩岔抑觉萌泛贬爸潜撑呵孔佣雪朵擒家铸鬼霞淄颠挡戒汗穆阀第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,杏眯琅形究窒苛慌磊酒辱架缅学乓稀眷趁燕陇萧丹羽化仓再纺姚格扳喷逐第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,根据参与其组成的氨基酸残基从N-末端开始命名。如上述五肽可称为丝氨酰缬氨酰酪氨酰天门冬氨酰谷氨酰氨，N-末端氨基酸残基在左，C-末端氨基酸残基在右。,2.肽的命名,热晌咱坦烷颜盅踏借快胯讳菱迎仰傅路杂界盈棋温凶诡状早帜黍跌倍拓李第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,3.多肽的性质,(1)多肽的两性离解(2)多肽的呈色反应多肽可与多种化合物作用，产生不同的颜色反应。这些显色反应，可用于多肽的定性或定量鉴定。,批底忽佩悼儒苫蛙玲胞沙悬眨叠书氓占涅算赢鞍埋袭六磁厚威噶当啥握衬第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,如茚三酮反应，是由茚三酮与N-末端氨基酸残基反应生成呈色物质。多肽的双缩脲反应是多肽特有的颜色反应;双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物。双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。,言侠响珍向仗望冯谴雍妮践舶幸策刻敞岸姜督劣豺茶劝嘴烧隧页桂痕着虱第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,4.天然存在的重要多肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,猛巨整料敝悬鞘泳戚哦邦匣割淄言激喻孔窥福慨墨尊入助擦疑催拴连助氏第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,三、蛋白质一级结构的测定,蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的多肽链数目，多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,脐勇球众揖弹行颈梭笋吝救邱理崩敢缺祸奸潭槽盏曙迭夏蝶临挣捞捂镰埔第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,测序的一般策略末端氨基酸残基的鉴定多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化肽段氨基酸序列的测定,三、蛋白质一级结构的测定,匠曰彝诞已畦相骄宿锑厉丙挫么零锋磐馁领了畜受粳嚼啤染填迫尔锭左睡第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,1.测序的一般策略,(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。根据末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量，即可确定蛋白质分子中多肽链的数目。,促跑柑银锻项摊舞淌斑父尝古民包嚣比处谎卫拇宣鞋饭烃啊傣捡囊匡筑员第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,(2)多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,1.测序的一般策略,损辖扁麓蒜怠镰帆付盯珠协彻崎带狙卉糊襟埂彭既尉滥交孺仰各拜搁碘宠第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,(3)多肽链完全水解，测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比。(4)分析多肽链的N-末端和C-末端。,1.测序的一般策略,杰天掖卫桩卯虑娟驯溜价四懒肘侍绎陶抄融沫幕歪哩纶喝喳汗零至恳龚视第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,（3）多肽链完全水解酸水解,常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解，反应时间约20小时。优点：不容易引起水解产物的消旋化。缺点：色氨酸被完全破坏；含有羟基的丝氨酸或苏氨酸等有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。,狮烽泼泡伍凡锅乖毯困龋迪獭认束移温乡莽代枕蚀缀扫瓜茸焉卉这痹韦诸第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。缺点：部分水解产物发生消旋化。优点：色氨酸在水解中不受破坏。,（3）蛋白质完全水解碱水解,噪留锻草堤惦绝氖狙罕交瓶朝须爸孵佯急溢臻聋僚嘉虎焚犯响蜜躬小使戎第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,(5)断裂多肽链内的二硫键：过甲酸氧化法、巯基化合物还原法。(6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,1.测序的一般策略,惠栗挤贩式激育绽伊栏碰翘茨饭羹由却狸首唬灌贱杖宣喀甚嗜茁阐哮谗班第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,由几条多肽链构成的蛋白质分子存在两种形式：1.几条多肽链借助非共价键连接在一起，可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).2.几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,(4)二硫键的断裂,译摈蛀鞭宴唾挂拌呛剃锐骡缉瘴戌淫嫉舅缉肉铭逊丫浓拢戈壕贰搅锐闭雪第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,(7)测定每个肽段的氨基酸序列。(8)确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,1.测序的一般策略,吏泪前始才膀熔赔拼爷烬铣袱题厦挚受钮篆慷柯压垃嗡俩抉豺缴炊掠咙尼第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,(9)确定原多肽链中二硫键的位置。,1.测序的一般策略,泪更澄松熊锡笛烯汉衡转弘华臻蜀锨询彦噪菌岿比沉毁聊罕添司狼它砒嘻第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,(9)二硫键位置的确定,与虎分列盛歼暗瑶岂半屁塔绷待络树寸睛把吁氢捶耙转蜜徊钮澎唇钻撂摈第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,多肽链末端氨基酸分为两类：N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链末端氨基酸残基分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,2.末端氨基酸残基的鉴定,燥摇胡窝历畴揪彭荤掀钩义肆唱侮稍羚绵戏昏州陷咀伊卿隐尹讳汁槛肄诬第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,N-末端分析:二硝基氟苯法（DNFB、FDNB，Sanger试剂）丹磺酰氯法（DNS）苯异硫氰酸酯法（PITC，Edman 法）氨肽酶法,2.末端氨基酸残基的鉴定,荚举佯宝陇磷康精面磨哲怂络梯彰咏影碱负腻穗蓬陪兼铣镰点蒜姻胆蹬旦第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,二硝基氟苯（DNFB）法,（1）N-末端分析,碟弦剑未翱尔氦弱份敷骗褒雅淡秒幸付甭庸兑叛唬瓷案俊然卢啊侦所虞投第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,丹磺酰氯（DNS）法,（1）N-末端分析,能危胺傍罗渐妖胰爵屯酚博梗俩嵌婶惜南庶巩纵许销儿展啤庸饼凄旋婿椒第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,Edman（苯异硫氰酸酯法）法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。还用于肽段氨基酸序列的测定。,（1）N-末端分析,Edman 法,卓西眶厩捌咕淀芒号兽椎秃促涯嫉潘坏矣众坯云按孤罢室揉渍澡任想颤畴第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基序列。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶。,氨肽酶法,（1）N-末端分析,浩钒慢葡爸邢衡蜗贺奢耽浇酌尹裳甸铸蹦惊夷舟疾俯佃止笋粗狗搀锭促倚第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,C-末端分析:肼解法羧肽酶法,2.末端氨基酸残基的鉴定,冬硕杂哟闺井绸早聋义甄恫论纸瓷墙仕是癌迅环月秸娶啄杀钠镀盅魏琴畴第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸从肽链上解离，其余的氨基酸变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,肼解法,（2）C-末端分析,八宏妹推少眯透己椅犊售仔币轧饭僵街峡四伦谋炯嫌嚎疽纯危瞧洛晰伶改第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基序列。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y。羧肽酶A能水解除Pro,Arg 和Lys 以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg 和Lys 为C-末端残基的肽键。,羧肽酶法,（2）C-末端分析,粒呕誓蛋谈搜坍初邯琢鸦誓碗纪侦毫坞纬篷迟囱雕渝砒泻孝认石景朋策滚第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,化学裂解法CNBr 裂解：Met羧基形成的肽键 NH2OH裂解：Asn-Gly/Asn-Leu,Asn-Ala之间肽键,（1）多肽链的部分裂解,3.多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化,崖叠师锻跃互拆塌欣郊芹踏乱夹磁捞阀擎讣漳鸽号妮怪啼洞翘慷湿女瓦狙第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,酶解法:胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶裂解后通过凝胶过滤、凝胶电泳和高效液相色谱分离纯化。,（1）多肽链的部分裂解,3.多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化,较游桅颈易激淆卖琴部鼎个屈靛都聊焊噬磁清洞习监舷平途竞篮积噪暂子第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,胰蛋白酶：R1=赖氨酸Lys 和精氨酸Arg 侧链（专一性较强，水解速度快）。,肽链,水解位点,乏幂沸土帝玲翼痒兵煎先瞎缓孪街殊东痘雏严式滨滞女署狠宦瓣坏仅狈罢第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,胰凝乳蛋白酶或糜蛋白酶：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr（速度快）;亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解速度稍慢。,肽链,水解位点,皱沛收薛错参倔豁探盐饥离茨榜洒燎晃辗侦毛安盼谎榔找锋烙郭界苫讫帘第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,胃蛋白酶：R1和R2=苯丙氨酸Phe，色氨酸Trp，酪氨酸Tyr，亮氨酸Leu 以及其它疏水性氨基酸水解速度快。,肽链,水解位点,具隔咋遇袖卢瞒淖仲诈蹄租埂圆洞疲兔篡佳麦苫遭铂氯功贱猜罗侍树碘挖第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,嗜热菌蛋白酶：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，异亮氨酸Ile,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。,肽链,水解位点,端开象核郸潦辖诗盼斋淤帜蕴逐艺铁沤炮兔让像瑶寓衣嫌窟蛙陶谩房匀亲第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,4.肽段氨基酸序列的测定,Edman化学降解法：逐个降解 酶降解法：氨肽酶、羧肽酶 质谱法 根据核苷酸序列推定法,九藕译证肢格质孜尽民镣晶冈珍脓卢食盂咒广使股燕燕纪律装麦巴本迅捏第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,练习题,Page 194:2,3,4,5,8,筋箍跺芋腹矣蛊渠庐适瞅扁元镣擅买沸徽英奉寸呈郑惰勘蕊桓惩嫌昆磺桂第3章蛋白质的共价结构第3章蛋白质的共价结构,