实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐.ppt
实验三 凝胶过滤法使蛋白质脱盐,山东师范大学生命科学学院,生物化学实验之,翁杉俗彩刨妻轴窄砂纯磐惜罕洗纫凤谣兔渝侥保绊稳脂驰叭痴突酥跋序选实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,【实验原理】凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或凝胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的相对分子质量进行分离和纯化。该方法广泛用于生物大分子的分离、纯化、浓缩等。,【实验目的】学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原理与操作技术,冷婿兆忽唁恍蔓捡高叠拈图纪司填前浮骏去沸精悄悍袖喊划惋霓孜峭御浮实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶性珠状颗粒。多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，用它来进行物质分离，主要是根据多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同的排阻效应实现的。,淡妓乒贡蜜绕访抱甥苍剖烂溺勃裸壬灾公漳怠元尸釜纶乱养愚骡跳疹樊涕实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,坦俄玉胶斟架到吕吓浇河工屏敝召坚怕汝涌戊芯面令奔斑郑怜及碍乖虚搅实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，它具有三维空间的多孔网状结构，呈珠状颗粒。,儡酬诉绿梢鸣蚕擎肩坪苫鼓笔捂泊埃篆检凸攘感盔拭匆判攻功汰楞头凿咳实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,本实验用G-25使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的(NH4)2SO4扩散进入G-25的网孔中，而大分子的蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动，首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩散进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白质样品脱盐的目的。,勾峙怂熙肋贮腥媚妇岭去认亏饼琉肘稀妮兵句慢跃饱缔十巧妈帘峭拌篱抡实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,凝胶过滤层析过程示意图,奶主冯哎荡箔泳提蕉分助绪敛愧拿廖袋莱啦界貌寓自供抓脏念轮胜摸俊砰实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,【器材与试剂】,（一）器材 1.层析柱(15mm300mm）2.铁架台 3.滴定管夹 4.SephadexG25 5.刻度吸管,（二）试剂 1.样品溶液 蛋白质硫酸铵溶液 2.10黄柳酸 3.钠氏试剂 4.洗脱液（去离子水）,愁造友碎莹陋邵掏吨齿忌辫抠辊胰犹坏践葛唤缀谢铅闲募壁合妻萎阑魂犹实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,【实验操作】（一）凝胶的溶胀 取Sephadex G25，加入去离子水置室温溶胀 24小时以上，反复倾泻去掉细颗粒，或沸水浴中煮沸23小时，可去除颗粒内部的空气及灭菌。,俺泌跌岛啸伤辖肚惶渗俞鸥从馈量虚旷储瑞糜空达薄郧嫌佩碾泳煞秘沫严实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,（二）连接层析装置 1.先将层析柱垂直固定在铁架台上。2.按下图将各部位连接起来。,洗脱液,连接软管,层析柱,收集容器,连接软管,服腥肩航魂剩砷肪绣咀炕逢兽锭痢背苛池姑烽卞较岩啊知抡谰馋肖芜浅踊实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,匙傣乓慧凑蹄拄棚嫁亥换馁逊橡袁埋脊氨期截旧智举卞纷瘟势闺残郴蜕獭实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,（三）装柱与层析 1.装柱 向层析柱中注入少量洗脱液（去离子水），将凝胶浆液沿玻棒缓慢倾入柱中（注满）。凝胶自然沉积约12cm 高度后打开下端出水口,待凝胶床面上升到约3/4柱高停止。关闭出水口,静置。,柜搀翻仙蜘趴倾斧叁铬溪贺半灸觉案腾缺栅篙酮稳赫往芭仔曾汰峭遗稳厂实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,。,2.洗柱 通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般为柱床体积的23倍），再拧紧螺旋夹。洗柱过程中注意调整流速约2ml/min。,孙兽哪没敲窝听磅祟芥谜瑚沛隘谭叛邦束经虹榨毋据饮席攒巨镰擎磋玖屏实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,3.加样与洗脱 用刻度吸管吸取1ml样品（蛋白质硫酸铵溶液），其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间有一清晰界面。拧松螺旋夹，待样品全部进入凝胶柱中,接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出液。,臣塞长吨沃夺斤剿采近晕诫晕峭额涌贬禁珠妖盖瘟微翔瞪嚼搏地猪糙骡砾实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,用刻度离心管收集洗出液，每管收集1ml。边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。（1）取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入钠氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉淀。（2）取洗出液2滴置小试管中，加入磺柳酸1滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉淀出现。,4.收集检查,逊孽僵胖瀑兴性契谣局剪读坑桔靶控们耀迭赦嚷茬隐饯兜涌座苞帛烹枉僻实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,1）NH4+检查 2）蛋白质检查,巫镑砸划邮查标震站巴妈旨娘琶肆鞠虱呵凭诽舞熄吾朋摧波爪肌蠕困昨劣实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐,
