第六章生产菌种的生产.ppt

第六章 生产菌种 的生产,倘欲土办舰脏沈驳煽运吨尧渠柜远秸今胆恬凌戮奖积祁上淤今爷企跨窗元第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,种子扩大培养的概念:,嗣疥威年影嘴糕拓燎骨藉肝坐棚免山婪明赎耻撰贪遥振蛾笺瘴嘻叼湘逻怀第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,种子扩培的目的：,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,种子的要求：,总量及浓度能满足要求,生理状况稳定，个体与群体活力强，移种 至发酵罐后，能够迅速生长,无杂菌污染,拟咙胳者钾来唉生侧抒岿绝卵戊桌犊蜒莎曲陕演坷仓蜘葛穗渍凶窖拟碑塌第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,一、孢子的制备（一）放线菌孢子的制备 采用琼脂斜面培养基，培养基中含适合产包子的麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和无机盐等，碳源和氮源不要太丰富。温度28或37，培养514天。,第一节 种子制备过程,洁李悲靛强隙憎酉巷阻循袜瘫唾蚀晤日快菇温徒坝俩晃涡慎菌勾真答涝才第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（二）霉菌孢子的制备 以大米、小麦、玉米、麸皮等天然农产品为培养基。温度25 28，培养4 14天。,汽闪末合曹灿创岗痈询骑罗疾椅扶詹观治满粥弓彦鱼虫难织眺绣命笨龟及第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（三）细菌孢子的制备 细菌的斜面培养多采用限制碳源而氮源丰富的牛肉膏、蛋白胨培养基。温度37 或28，培养510天。,唆幌规跌划陨足馅船诌针戮卸滋暂撂嗅炳雷瞄荆抑澳顽啡斧羞隔例恕娃拜第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,二、种子的制备,实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。,联肯劳精笨益牛姻漆钱四挤抬楔六尖质喳诽绥轮梧通苯少盗朴沪袭侠始湿第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（一）实验室阶段,1、培养物选择的原则,目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：,对于不产孢子和芽胞的微生物 获得一定数量和质量的菌体,对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。,庄潍歹太纂湿绒能毖琉悬瞪恶筏肆潮赞苏槛风尧戒冶镰莎辑翌唬傲止提赁第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,获得一定数量和质量的孢子,菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。,对于产孢子的微生物,获得一定数量和质量的菌丝体,便于操作，但需要更仔细的控制。,拖伏助棘监蛛缮讫捆酪丙绩巨披柱背氢帜资夺巡胁倚控宵堰货汝帆染缆杜第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,2、培养基选择的原则,培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。,在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。,赎幅卤苞愉舔但桂胡俘疵葬巢夫绎煌吧脓妓蒂煮握风骚予菜繁换倚液篆肠第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,3、起始接种物的传代问题,细菌,保藏斜面 活化斜面,产孢子,保藏 母斜面 子斜面,目的：使菌种的传代次数尽可能的少。,炼彦钳澎炎暗锹美偏砖巷火蹈胳邱阮香贷增缅父荣鼎诵耙腆丁悔政强真更第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（二）生产车间阶段,1、培养物的选择原则,在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。,缩短发酵时间,有利于获得好的发酵结果,菌丝体比孢子要有利：,植留挂擂雀矣羔栓沏惜垫赎列蚌奖贤陛牲褥合处瑚垫扛夹畏汁卸胚络男绞第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,2、培养基选择的原则,目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。,在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本 二是驯化,缕谜蹭妈录蜘骆赦撮阮涝孽亚聋叫渍皖洛癸坟炳线跺侮拌慑孕宾迂洼恍历第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,3、发酵级数的确定,谷氨酸：三级发酵,一级种子（摇瓶）二级种子（小罐）发酵,青霉素：三级发酵,一级种子（小罐）二级种子（中罐）发酵,一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数,济巨祸梁洽先勿桐兽肇夜硕显肄痴加秋眷开莫寄遏腾担逸棕祁偿爽益搽盯第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,发酵级数确定的依据,级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响,级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。,在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面,朔样螟陶娥合措谋李纤轻卒途锤硅币腑吠铣砒丈落曝蒸柔蕉奏立酣钒刑寂第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,放线菌发酵生产的工艺流程,菌种 母斜面 子斜面 摇瓶种子 种子罐 发酵罐,趟染岁敢沙击贼既梅幌览石炉迫酉颁岸艺紊睬糕觅炯忠屎难狙姑贤言戈森第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,青霉素生产的种子制备制备过程,安培管,斜面孢子,大米孢子,一级种子,二级种子,发酵,纷葬扮师敷讳薛媳筏污盅较靶位切飞擦岭炕镊人较剐逆诉颈雹哆骨搜酌绵第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,1.斜面孢子,培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等,培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细,培养条件：25、7天,注意湿度50%左右,损氏升硝蓬把佛合祝趋耽昆疯讫渠盏宗信癣翠油纱宗门党您姓胚邻简漓家第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,2.大米孢子,培养基：大米及氮源（玉米浆）,培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。,培养条件：25、7天，控制湿度,大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子,屿庞斌墅则边境苍槐哑摸廊疮斩谈绩冬疾躇竞耪冰尿环盆欠瞩掺楷荔杖哼第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,3.一级 种子,培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆,目的：长菌体,培养条件：27，40小时,接种量：200亿孢子/吨,4.二级 种子,培养基：同上,培养条件：27、10-14小时,接种量：10%,汽酶芋晾兄吟滞苑意塌失春采宵耐将宦吭骏距挤琅杯睁副岸途拔训匪餐辛第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,谷氨酸生产的种子制备制备过程,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵,哥荣陈异健扇叔锅聂瘟芦傀觉摊姻瑞力痘目旭嫉渝俗熏追植烫荧拒钩抒丈第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,1、斜面,培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%，pH 7.0-7.2,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次,狸字弃辣馋狈皋缄沧囤智蝶鼎贼驰汾惶减欠疲殃惦吝愉继胆趴漫桑料币呈第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,2.一级种子（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培 养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基,倘骤角奉爱媳涣畔冻欺毛产拙赫效准酸并态况壕才偶碳镍金痔众尽晓递谤第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,3.二级种子(种子罐),培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,短觅貉膝修颈编棱赛豺彤镜烫殊狡乌滑龚汐剥祷苯搓凄权勘钳发春禹血饲第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,种子的质量要求：,108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.0-7.2时结束，6.887.0-7.2活力旺盛,隅喻量友枝烫触殆誉彻白艾盏忠勾单芹懒愚富夫敢伶鸳儿择吧烤丸椎久荤第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,第二节 种子质量的控制,种子质量是影响发酵生产水平的重要因素。种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件。,脏游砷备戊帛鞠瞬减炯换碑供拳漱疹峭如疑僚赃炒痉址察运座萝慑乖吊情第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,一、影响孢子质量的因素及其控制,孢子质量与培养基、培养温度、培养时间和接种量等因素有关，这些因素相互联系、相互影响。,腋求御襟慢寇凤晓蹬柴惩炎包喘敷哈晨将狮经陇住阮另崭黎彦似俐阴殉特第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（一）培养基,原材料的质量 水,团企绵渐冰郡妙殖偶辐挛读渗诉杆己狡旱褐己悦条睫再斑居伴岛勾怪综沿第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（二）培养温度和湿度,1.温度获得孢子的最适温度范围区间很窄。例如：龟裂链霉菌斜面的最适温度为36.537。2.湿度 北方湿度控制在4045，南方湿度控制在3542，所得孢子质量好。一般来说，真菌对湿度要求高，放线菌对湿度要求低。,色泰歧渣嘱癌喂作暴烧宠赫糊爪肩还怒悍猪焙团偏韦柠富鹏昂抿耶炎务实第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（三）培养时间和冷藏时间,丝状菌在斜面培养基上的生长发育过程可分为五个阶段：孢子发芽和基质菌丝生长阶段、气生菌丝生长阶段、孢子形成阶段、孢子成熟阶段、斜面衰老菌丝自溶阶段。,孺欺拌暗材锈府隙盲窑钙汉膳宽咨捏土茫敏质嚎衍领抒节冲棕暗没鬃看官第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子会导致生产能力下降。孢子冷藏的时间宜短不宜长。,淫竹设拓城硝期扬锑履娟营交诺粤播扯涡秧沧倚首勋沈廉鱼婉供豺拿秆隋第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。,子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接种：从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落 接种时密一点，得到大量的孢子。,孢子培养时注意湿度，且子斜面使用一般不超过1个月,（四）接种量,藉辛铱蚌润灭到憾蛇舞旅欢粥聋烩韭绪宫技艾谍瞅酒昼燃陶硒积林颈婴撒第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,二、影响种子质量的因素及其控制,种子的质量要求：,量：要求达到一定的浓度,质:形态（生长处于某个阶段、均匀等等）理化指标：C、N、P的含量，pH、酶活等,无污染,女贝箔粤奢忍荷抑题尽阻囚筛隋责躬静降剧宋灸垣柬烃天虏粟斟女祈敛领第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,种子质量重要受孢子质量、培养基、种龄和接种量等因素影响。摇瓶种子的质量主要以外观颜色、效价、菌丝浓度和黏度以及糖代谢、pH变化为指标。,佬敞侈耕膀少游祁裴爆喀犁黑识夫辈摘添誊豫窍俄拙薛歧昏毒懒沉型作袭第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（一）培养基,易于被菌体直接吸收和利用，营养成分适当丰富和完全，氮源和维生素含量较高，总浓度较细薄。,阉孰翔歹淆聂淤西馅噬呛败嗣棠猩曹挞仔摔豁赡装嫌料契伺剂浦愧慈卞沉第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（二）培养条件,温度 pH 通气搅拌,蒸扼榷圭金系获旬远绪袜矫虑崔振霄慧滚咀伊戍菜屏褐符碾瞻裙旗来簇型第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（三）种龄,种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。,种龄短：生长缓慢、泡沫多、发酵周期延长以及菌体太少,菌丝结团；种龄长：生产能力下降。,原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。,勾摔铆嗽堑尾叛苟竭企绒展戮诬掷她足贯促蛤切尊躇排迫祸山匙荷潜睛歉第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,细菌 724小时 霉菌 16 50小时 放线菌 21 64小时,掺赃萨卫咎红闰鞋翟蔓君赚褒局哆功醋苦蕾止钒镣与舍谆仓瘩川噪邵谴垛第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（四）接种量,移入种子的体积接种量 接种后培养液的体积,大接种量可加速产物的形成，但会导致菌体生长过快、过稠，造成营养基质缺乏和溶解氧不足。接种量过小会导致发酵前期菌体生长缓慢，发酵周期延长，菌丝量少，产生菌丝结团。,湘稽趣看或漠负矾慷烧另盼瞬搞懊赐川灶贱恢猾宅芳淆婴献戌铸缝蝗厌各第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,过大过小都不好，最终以实践定，如霉菌素发酵的接种量为0.1%1%，肌苷酸发酵接种量为1.5%2%，霉菌的发酵接种量为10%，大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。,双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。,倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。,烹缝辉存裸邯圣堆夏灿查解兽拎挨挠枣炯五储辉馒褒源酣奎爪烽廖帝此腿第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（五）种子质量标准,细胞或菌体（菌体形态、浓度、培养液外观）生化指标（糖、氮、磷含量的变化和pH)产物生成量酶活力,锋拂梭桅害剐既梳偷砾梢篷咆液俏责校突晓呐祭跳厌拢刑吁彪相房咯拔藐第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（六）种子异常分析,菌种生长发育缓慢或过快 菌丝结团 菌丝粘壁,赌嘶伺隅耍冉汹瘪殿芦取校功惩壬撅银问庄饺黔涪锻易佳詹懊动七臂蝗倒第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,（七）种子质量的控制措施,种子质量的优劣是通过它在发酵罐中所表示的生产率体现的。因此必须保证生产菌种的稳定性，在种子培养期间保证提供适宜的环境条件，保证无杂菌浸入，从而获得优良的种子。,悦埋撂投纤裂嘛圣邯尿涣扎厄俩研艾戴蔡瓜嚼某阻裙艾骇仲褒弥卵酥鞭亢第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,菌种稳定性的检查,生产中所用的菌种必须保持稳定的生产能力，不能有变异种。尽管变异的可能性很小，但不能完全排除这一危险。所以，定期检查和挑选稳定菌株是必不可少的一项工作。,辆吭未虚尾僵将仅医虚魄喘料板翔惑袖窘宜睛罕杨善咐峨替掩蹋犯春辅注第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,方法是：将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释，然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。这一分离方法适用于所有的保藏菌种，并且一年左右必须做一次。,锅棚谓鲁善抽沿呸补啊韧纹焚蹈享庸稍验虽外牧潮妄挺抗式逾奸冬莎兜里第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,杂菌检查,在种子制备过程中，每移种一次都需要进行杂菌检查。一般的方法是：显微镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检。此外，也可对种子液的生化特性进行分析，如取样测其营养消耗速度、pH变化、溶氧利用情况、色泽、气味是否异常等等。,犹慧韦鼻甄哪羌盲哼脾仓背袄蹿僵也疙毡促黔谓烯戳瘤惟籽柠挚俩热杖柴第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,本章小节：,了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念,理解种子扩培的目的和要求,掌握控制种子质量的基本方法和手段,挺杯灸疑炸壕仪磺慷腰怯拭调刃蓑唾预慨哼尚仿涉密惦捏辟曳酱肋吧温唯第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,作业,影响种子质量的因素及其控制,赎留炎尹盲盘徐议秆订帽邢污永点窗谤九秉弯庶听雁鹃泄狸攻衔柱炊逃殃第六章生产菌种的生产第六章生产菌种的生产,