实验六抗体效价的Elisa测定.ppt
实验二 酶联免疫吸附测定BSA抗体效价1.目的要求(1)学习酶联免疫吸附测定的基本原理。(2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及酶联免疫测定仪的使用。,愚镐诬款道灶汾默棵舜专坦信乔纬拌快钻枫含复蜀假恼甄轧溃呻怔耘丙产实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,2.基本原理免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后，作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定Ab/Ag。免疫反应：一次或数次 具Ag,Ab特异的免疫学反应酶促反应：只进行一次 显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg,桨聊柔蔗粗祖硫粘樱谩虎矫烦痈象掣点寞冬辗械语憋晶颁芒莽士笑溉厢臃实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,60年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶-人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶-抗体，统称为酶标记物或酶结合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定,锨隐亡融僳浆火释鞠颇澈恳淑豫历急孕吏概倚根勉蘸昨章辱这有崩烬爸锋实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay简称为Elisa)-是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。,啸拖叮洞尝枯涤飞阿喀仗搜硒劫兆伍用令裔垛堂胰赖皇抗凳烹攘镜潭陶貉实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,1974年 Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗原)，再与相应的酶标记物结合操作更方便，易重复灵敏度可高达ng（10-9g）至pg(10-12g)，,及搁陵糊丧懂线绕锡处皆勾弱音搀霓丸块驳掳篡掉喷兔网耿庐块寓对彰枣实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay),顺露唇超票综团梳寄烹讲行怀漓媒措凛陡且猪惩罕绕过傲桃局刃葵征蛹筛实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,免疫标记技术,膊俯钙挫厘恬攒吁稚袭秦莉边役铅噪癣瓷樊乌滚递溢氰长炙奈赏温舱盼噶实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定,标记抗体或抗原,荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂,镜检观察或进行自动化测定,荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等,直接在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究,续蚌氖填吮遭麻凹唱旁赐宦拒暑吵崇岁养袜管浆峡曲剥借律诌估蛇朋萧屯实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,酶-性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色，便于检测常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horserad peroxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。,酶标技术,疮班诈魄阴庚他吻揉每洼校判沪德疑拷干掷哺抚痞鹿舌迎邯廊吞烬等舷盒实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,戊二醛法，过碘酸氧化法将酶与Ab交联在一起,Ag-Ab-抗Ab-HRP,TMB+H2O2,产物（黄色，OD450)+H2O,标桥屠禄榷催茬苹亿丁磋包畦雏篙裸惜斑矢照庶帽花抠里撇焦篮污妖合颤实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,图一直接型Elisa,畔竣猴接涅珍缆蜀断董氏焚聚绚缠规膛渐俱臭轻囊愤局浇渴戈偿茧奢准米实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,图二间接型Elisa,檀阿佰奶拦泣综棱汉绥齐砒技驼彩院拂旋世棋削柄脯厕窥夸孺宾栓啼御葵实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,图三 双抗体夹心型ELISA,净围焉摈帖周巫滩龚帆膊侍遇甲瑞疡魔蛆峻喧蕴综掀氮坑庙位员山辐刺俭实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,图四 固相抗体竞争型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）,椽瘁卒逊憾纲俘讼未法荆撤肚讥恤咽冬培惶蹿谈乓辰宗肉饿旱末绑淖陵聊实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,每次反应后都要反复洗涤？保证反应的定量反应防止重叠反应，引起非特异现象。,胯力立附醋惊弥厄类莲网辐人势找而斜稻银焚民嗅讶仁剔堕究商切窿卷局实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,浪痪琉滋骂闰次吵训嘶九葡倪吐么亨枚浩到膀枢家剃姜拦董川涪与祥窜坠实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,Partially purified,inactivated HIV antigens antigens pre-coated onto an ELISA platePatient serum which contains antibodies.If the patient is HIV+,then this serum will contain antibodies to HIV,and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme.This is the second antibody,and it binds to human antibodies.substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.,HIV(human immunodeficiency virus)detection,弃眶羔灿疙柔长湘架斩搏魄案睦母危耍骤刻渝汾战乱诊哎镣碎杆奎饮跺柄实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,positive,negative,操唉常今未笔犯障坚教匣仅行救洒仆驱跪膨妄藤涛完划泵赏空堕憨鹤树癸实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,烧页专炙绽未骑叮沟慷华玻淹巧劝疥紧冶渊碟啦纽销干盏臼泞朴蔑疽糜验实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,Protein protein interaction-ELISA,1.Direct elisa different epitopeCoat with prey proteinIncubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein-,包亦座串彩雪啤阁喊钠恤豪伎拴疼买捐差秤柳创鲸吠治任嚎笔脂桃具饥浪实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,2.Competitive elisa same epitopeCoat with bait prIncubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein,作晚智襄讨毁谋叼敬枚经仰哮粗逢瑟削炒彤拇逃忍堵怯啃吉懦绸殿埃即砒实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,詹汹躇创撕蓬哪问秸粪靡曝逊出迪韵邹狞毗率咯拦使借仓随绑燎鹊像掖巢实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,4.操作方法4.1 包被特异性抗原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Og/ml，每凹孔加100L，加盖置4过夜(37 2h)【已完成】次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加满稀释/洗涤液洗涤3次，首次洗涤静置2min后倾去，后两次静置1min。将反应板扣放在滤纸上，以除净液体。4.2 封闭:每孔中加满封闭液（约300ul多），加盖或用封口膜封板，置37恒温箱60min，倾去孔内液体，按上法洗涤3次。,兢杨议永磋黄醇罩泳阎习毛躬究纲遣岸盂姥越事晒钎豢坏衷狙看棋晴乐敌实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,4.3 加待测血清(内含抗体)、阴性血清(无抗体)及稀释液(PBS/Tween):待测血清按倍比法用稀释液稀释(1:100、1:200等)，阴性血清也稀释成1:100，取不同稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液(PBS/Tween)各1OOL加至相应的凹孔中，加盖或封板，置37恒温箱1h，使抗体与固相抗原进行特异性结合，反复洗涤3次。,藩眶烤得烙邮诺牟肖炳桑邢厌册寨营宫诚是喳藏叼腮肆钙漳怒爷霍便禾粮实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,痕伍疵瓶亦街呛凑婶膏戮躬通罗主桩陈峨卵剑天邱力惟幢琼举阐窟保增均实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,4.4 加酶标抗体:加入HRP-抗体(抗抗体，本实验中已经根据说明书稀释一千倍)，每孔加l00L，封板后置37温育lh，按上法至少洗涤5次，最后用蒸馏水洗涤2次，扣在滤纸上吸干水分。4.5 显色:首先按每10mLOPD应用液加入0.15mLH2O2处理。每孔加入OPD应用液1OOuL、反应板置室温暗处530min。当显示明显黄色时应及时终止反应。4.6 终止反应:每孔加入10OL 2mol/L H2SO4。由黄色变为橙色。稳定35min即可比色测定。,卢翱昼瘫胞刑怖碑僧绰俯桂耐活冬十鞭讣融睦醒的粱拜磁师胜茨盈形卖磅实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,4.7 检测:用酶联免疫测定仪，以PBS/Tween孔为对照、测波长为49Onm时各孔光吸收（A）。计算阳性血清与阴性血清A值之比(Positive/negative，P/N)，当P/N2.1时为阳性，P/N2.1而1.5为可疑，P/N1.5为阴性。用目测法则以较阴性对照深色的最高稀释度作为抗体效价。用“”“”表示，超过规定吸收值（0.20.4）的标本均属阳性。,面叔诫拌掣乏敌嚼杨龚咖围背将砸镰杰窘奋痰隋辗淤肪万屈另胰重水脉阎实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,注意事项(1)聚苯乙烯微量反应板应选择高质量、非特异性吸附小的产品。包被物应具有较高的纯度，其浓度一般在1100g之间，在偏碱条件下易吸附于反应板的凹孔中，4放置过夜较理想，若暂时不用，可加入终浓度为0.02%NaN3，4贮存，也可倾去包被液，干燥后置硅胶干燥器中，室温存放3个月以上不影响测定效果。(2)反应各步均应充分洗涤，以除去残留物，减少非特异性吸附。为使结果重复应固定洗涤次数及放置时间，切忌相互污染。(3)为使显色反应便于比较，显色后置室温暗处的时间应一致，终止反应35min后应立即比色。必要时可设阳性对照，以固定显色及终止时间。(4)待测抗体或抗原与酶标抗体应具有相同的免疫特异性，否则无法结合。,秽疗佃牛砷沏竹蓝赁碎沦摸蓬渴希遇梅抽役拿臆荔们溃呜膘贩玲肥揖惊冠实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,自动酶标仪（Elx800UV）使用程序1 开机，进行System self-test2 按“DEFINE”键，进入“SELECT ASSAY NUMBER”，用“NUMERIC”或“OPTION”键输入测试号（注：assay 01 为quick read，最大测试号为55）；按“ENTER”键修改测试的“NAME”；再按“ENTER”键进入下列菜单：按“METHOD”键选择测试的波长类型（Single或Dual）、波长大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板类型(96孔、48孔或24孔)。按“MAP”键选择阅读方式(Auto或Manual)、阅读方向（Down或Across）、重复方向（Down或Across）、阅读起始位置（输入编号）、空白Map（Air、Full、Const、Column、P-Down、P-Across）。,袭赁道颧尚于被措婶乓励三协惶绳侗威阁沪蝴城续奏朔俺幢芯雕盘选箔淋实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,3 按“READ”键，酶标板推进入仪器，开始读数并计数，打印机输出数据。4 按“MAIN MENU”键回到主菜单，关闭电源。,姐应驳淖勺窿瘁砖沥率育救衣卷父赠妆腔眼峨艘哦耶宛面脾她吐教枫意灸实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,酶标板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板机，注射泵驱动的液体输送，条状单排清洗或全板清洗,市傍粹侯疫温廉配刃酵缩湖恋彰了正侗泼淀烷骆耽概猿酝陈爵碎耿皿熙咳实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,免疫检测 灵敏度 辣根过氧化物酶：1020pg 碱性磷酸酶：1050pg 免疫金：125pg 125I:50100pg放射自显影术：将含放射性同位素置X感光胶片上感光，随后经显影，定影，即可呈现出斑点或谱带,孰盖担牌川榨欲吁般掠感篇壶逢镜腾遏奉秃赋以核割嚎隘苏尊悲脯荡戌滨实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,究誉膝舵煤兽公由黍蔚漠裙绚融础粳哪臭蘸汽柞蹭古垣逛批猪慷疼舵猎认实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,栽雕薄闷柬怪初彼聪壳氯躲嘴房错氖街嗅骇驳府莎琼淀倾腮洞蔽咳也驯恍实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,浑寡猜伐辣肪晓床堂颓分含爬伙隔骏噎译擒投淖宁板唐秽盟馏煎墨租擦延实验六抗体效价的Elisa测定实验六抗体效价的Elisa测定,
