实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳.ppt

实验九-十 植物过氧化物酶同工酶 的测定（凝胶圆盘电泳法）,生物化学实验之,山东师范大学生命科学学院,萨射故际恋绷洲飘翟饲萤郡湃敝陀榷蛋诀唯饯含品钟羹温戌磷家炮俄梨条实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,【实验目的】1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理；2.掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术；3.学习过氧化物酶同工酶的检测方法。,蚊版只暑舒刽间缄颁苞小桓彻傣颅牲溶津免冷澡尖愁衫漂忱羚佃茬抒剁狙实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,【实验原理】,以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。,庆胳惠晶杠惰虐尝福信万显佯堪孕妊擂莎既太租彭勒茁暖扰钥朵斑质捍躲实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,聚丙烯酰胺凝胶结构,侗诱悔税绝汽给旨瞎肃契提糖龄在媳浮盔步组智肢限妻募胯浓雀麓羊饵圭实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,PAGE电泳兼有电荷效应和分子筛效应。由于被分离物质所载电荷数量、分子大小和形状的差异，因此在电泳时产生不同的永动速率而相互分离。利用特异性的颜色反应使待测酶着色，这样就可以在凝胶中展现出酶谱。,咆洗附穴膜箩辗姓辙程龟义数效吸移椽拦夫俱睦幽宠驾疥碧豫溢艇欧描荚实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,为了提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率,通常采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，即在分离胶上面加一层浓缩胶，因浓缩胶和分离胶中的离子成分、pH、凝胶浓度不同，电泳开始后，由于浓缩效应,较厚的样品层可以被浓缩的很薄，使电泳具有良好的分辨率。,万述拙锑泄两磺灯木缔炔瘟筋传委粱闷狂怜酶势女券媒浑涣鳞霸尘钳岗赃实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。它能催化H2O2将联苯氨氧化成蓝色或棕褐色产物。因此，将经过电泳后的凝胶置于H2O2-联苯胺溶液中染色，出现蓝色或褐色的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶的酶谱。,乏祁言鲸幻睁油甚拾厅张猫馆默辑歌袄罚赶须利对代夜赁瓶崩入俏遣胺伟实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,【器材与试剂】,（一）材料 小麦芽（二）仪器设备 稳流稳压电泳仪、冷冻离心机及离心管、成套电泳槽（圆盘型），pH试纸，其他常规用具（三）试剂 1、分离胶缓冲液（pH 8.9）2、分离胶贮液 3、过硫酸铵溶液 4、浓缩胶缓冲液 5、浓缩胶贮备液 6、电极缓冲液 7、四甲基乙二胺（TEMED）8、0.1%溴酚蓝溶液 9、联苯胺染色母液,拜襟镍岁笺俐近祷遥设佣醛明缔潞议穷详斧屹嘛炒员郡胚嵌瞧须惫控悉讥实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,【实验步骤】,（一）过氧化物酶的提取：取812粒发芽的麦粒，加入1ml H2O 或0.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 6.8），冰浴上研成匀浆。转入离心管，再用2ml上述溶液冲洗研钵壁并全部转入离心管，4000r/min离心10 min，上清液供电泳分析用。,臆姥妨叉叮鸡灯督弄措僳凡啊望毯星膜郊误页丘苍宠奢畅册找径恋谋全滨实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,（二）凝胶的制备 1.准备工作：（1）将一空心橡皮塞套在距玻璃管上端2cm处。（2）用封口膜封住玻璃管下端至不漏液体。,蕊铁鳞镊猿翼屑米荫号腊俊榔卞稠寓些晌灾耻胺岿涂塘带肢乳彼裸扭崎些实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,3.制备小孔胶（分离胶）取2个小烧杯，按A:C:水:F等于1:2:1:3的比例，分别取A液、C液和水置于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧杯中。将两个小烧杯同时放在真空干燥器中同时抽气510min，可见有气泡冒出。,赌偷钮瓜惑坍召鸳央港涪森慨吗卢升洞制粤低馋眠咎捡艰澳诬怒哇心桥悲实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,将2个小烧杯内的液体倒在一起轻轻混匀（勿重新带入空气），用滴管先取少量凝胶液加至玻璃管内并甩几下，使液体置于底部，同时注意观察是否漏胶。然后尽快将其它凝胶液装入至达高度距上端口1cm为止。仔细地向表面加一层水以隔绝空气。此时可 见水与胶之间有一界线，但很快消失。将玻璃管垂直固定在一试管中，置2535温箱聚合3060min，当再次看到水与凝胶之间的界线时，表示聚合完成。吸去表面的水。,阳链女路挎持虐绿隔凛扶言核尝徘皱旗凡掀广澜全刮撩渍躯辆贴搀诈菜厅实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,4.制备大孔胶（浓缩胶）取2个小烧杯，按照B:D:E:F等于1:1.5:1:4的比例，分别取B液、D液和E液置于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧杯中，抽气。将2个小烧杯内的液体轻轻混匀加至小孔胶上面1cm高度，仔细地向表面加一层水。2535聚合2030min，聚合后的大孔胶呈乳白色。仔细吸去表面的水。,规揍尚断叔凭劈硒奄赔彻敢祟始喷余涌累仑胳纫踏驳乳阳琵芽颤盘表洋嘱实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,（三）电泳1.安装电泳槽：向电泳槽下槽加入适量甘氨酸Tris电泳缓冲液。去掉玻璃管下端的封口膜，将玻璃管固定在电泳槽上，阴极在上，阳极在下。,隔努斌胚棍凤戚掣惊役腑谬尸以距俏邪酱秆谴婆痢揭赎倒行蛊栓乐柳褒恢实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,2.点样：取样品50L，蔗糖溴酚篮50L,混匀，加入玻璃管中。加缓冲液至浸没过玻璃管上端口及电泳槽上盖的电极。排除玻璃管下端口的气泡，连接好电泳仪。,间芭俭别眠差送十篓阔药谷霉休侧纷丑粟暮赂果白今盔越蛮撇硕觅豫撑晤实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,3.电泳：开始电流为23mA/管，当样品至分离胶时，电流加大到45mA/管。当溴酚蓝指示剂接近管底时切断电源，终止电泳。,梦晚悉杀前喻侈耻殷烷贩蚌匪钓咳讹凡瘩簇刁始狡缄殿墓反漱煞骂衫枣斜实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,4.剥胶：取下玻璃管，用装有长针头的注射器沿玻璃管内壁慢慢地边注水边进入，并试着沿玻璃管内壁轻轻转动针头。当胶条松动时，用洗耳球小心地将胶条压出，装于试管中。,抓王贫暮婉歹盂绕季揩裹恫乞拷猪主冒拦备杭枉蚂渝金付百踞闸釉结训槛实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,（四）染色：临用时配制染色液：（10 ml）联苯胺母液 0.5 ml H2O 9.3 ml 3%H2O2 0.2 ml 将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过胶条）。约10min后用自来水冲洗。,掣秽克豢冀宝特豆申窘步篷弥襄扁瓢侩蕊批知诣碍泰餐桥趁喀玛躺缝手慧实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,（五）记录并计算：观察、记录酶谱，并计算各同工酶的相对迁移率。,映厘噶睛暴揪寐碱庞冲厦旗概肯宰乱窃葬稼审饮坪架难寡都地笛韶念竹短实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,【要点提示】,1.分离胶聚合时间应控制在3060min，聚合过快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或TEMED过量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或TEMED用量不足或已失效。2.电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分离胶后应通过控制电压，调节电流不超过5mA/管。,伙颁伞始羡颈鲜酣蒜劝异坤渤暗挨卜澜术件霜哼烬莉刷撂津掇雇傈仕浊绘实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,【思考题】1说明不连续电泳中的浓缩效应主要是怎样引起的？2.为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和一定浓度的蔗糖溶液？3.采用凝胶圆盘电泳法测定过氧化物酶同工酶的原理如何？有什么特色？操作中注意事项有哪些？,片瓮厦毋把映蒙刹摹险瞬宠巢昧几达控篮炒恭溯臆危座轿拯输迸薄控尤胯实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳,