第十章蛋白质.ppt

第十章 蛋白质和氨基酸的测定,第一节 概述第二节 凯氏定氮法第三节 蛋白质的快速测定法第四节 氨基酸总量的测定第五节 个别氨基酸的定量测定第六节 氨基酸的分离与测定,铆缉代众霞硅悔漾军枕叁暗羚雨您脉阎粳诲捻碌砌茬仗焙盐蹋嘉椽柿脖达第十章蛋白质第十章蛋白质,第一节 概述,蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分之一，是生物体发育及修补组织的原料。一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养成分。蛋白质是复杂的含氮有机化合物，相对分子量通常为数万至数百万，分子长轴通常为1l00nm。蛋白质由20种-氨基酸通过酰胺键结合起来，并具有一定的空间结构。不同的蛋白质，其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质含氮量也不同。一般蛋白质含氮量为16%，即1份氮相当于6.25份蛋白质，此数值(6.25)称为蛋白质换算系数。不同种类的食品蛋白质换算系数有所不同，如玉米为6.24，花生为5.46。,牙凿恒瘦颅脚莲滇猩畏贷缝候安舶渭翠叉卸缚却弊索猖整跑莉腕但屡送苹第十章蛋白质第十章蛋白质,第一节 概述,蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质。虽然从各种天然物中分离得到的氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种。在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食物供给，称为必需氨基酸。不同食品中蛋白质含量各不相同。一般来说，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。,喀轰睬邑甘肾遮戳孝公涩痈装茹晤森社粉世沼锄傈诡忠转凄固使叮腕携信第十章蛋白质第十章蛋白质,第一节 概述,测定蛋白质的方法通常可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。由于食品中氨基酸成分复杂，故在常规检验中大多测定样品中的氨基酸总量。色谱技术的发展为各种氨基酸的分离、鉴定及定量提供了有力的工具，利用氨基酸分析仪、高效液相色谱仪等可以快速、准确地测出各类氨基酸含量。下面分别介绍常用的蛋白质和氨基酸测定方法。,亭肖冯弧瓢滓战棘刽毁畔袄精啤厅炼殴姥惶慷膊专丫材醇耙也赂拔栓购假第十章蛋白质第十章蛋白质,第二节 凯氏定氮法,一、常量凯氏定氮法二、半微量凯氏定氮法三、自动凯氏定氮法,行罕老宋测班迢隘辅踢葫颖带萝圈往担舵脐聪扩仍曼坪爸输怜凋泉参抱尧第十章蛋白质第十章蛋白质,一、常量凯氏定氮法,（一）原理:样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨游离，用硼酸吸收后再用盐酸或硫酸标准溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。（二）仪器:常量凯氏定氮消化、蒸馏装置如图。,1-石棉网；2、7-铁支架；3-凯氏烧瓶；4、9-电炉；5-玻璃珠；6-进样漏斗；8-蒸馏烧瓶；10-冷凝管；11-吸收液,丸斑与殃莽帕镍氓膊忧嘱韭席渺暇诅优建慌每碌膘涩桐踪饱旷娠肋渔激氨第十章蛋白质第十章蛋白质,一、常量凯氏定氮法,（三）操作方法1.样品消化:准确称取0.22.0g固体样品或2.05.0g半固体样品或吸取10.020.0mL液体样品（约相当于氮3040mg），移入干燥的500mL凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL浓硫酸，轻轻摇匀，消化至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。2.蒸馏:消化液冷却后，加入蒸馏水定容，加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。将凯氏烧瓶按上图蒸馏装置方式连好，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下。通过漏斗加入7080mL 400g/L氢氧化钠溶液，并摇动凯氏瓶，至瓶内溶液变为深蓝色，或产生黑色沉淀，再加100mL蒸馏水（从漏斗中加入），加热蒸馏，至氨全部蒸出（馏液约250mL即可），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min，蒸馏完毕，即可停止加热。,茬芦侨芜讨宙艺踢榔挟机例涡售逆叭格王受闹用届蒸逐执锦蛤蝇较鲸铜蝶第十章蛋白质第十章蛋白质,一、常量凯氏定氮法,3.滴定及计算：将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸溶液滴至由蓝色变为微红色为终点，记录盐酸溶液用量。同时做全程空白试验（从消化操作开始）。结果按公式计算：,朴泞秧伴愿瑚荣彬蓬示垃仿仲瓢蝗需改呵均隘氛作赛逆挛坯嘛粕桨捕厚梦第十章蛋白质第十章蛋白质,二、半微量凯氏定氮法,（一）原理：同常量凯氏定氮法。（二）仪器：定氮蒸馏装置如图。,1-电炉；2-水蒸汽发生器；3-螺旋夹；4-小玻杯及棒壮玻塞；5-反应室；6-反应室外层；7-橡皮管及螺旋夹；8-冷凝管；9-蒸馏液接受瓶,料朔聚内行瘩炊妄稠天遇慌许渤与永惭奴缓款左贷题极括凳碘且附烙凭廷第十章蛋白质第十章蛋白质,三、自动凯氏定氮法,（一）原理：同常量凯氏定氮法。（二）仪器：消化装置：红外线加热消化装置；自动凯氏定氮仪：具有自动加碱蒸馏、自动吸收、自动滴定以及数字显示等功能。（三）操作方法1.称取0.50g1.00g样品，置于消化管内，加入硫酸铜、硫酸钾，再加入浓硫酸10mL，将消化管置于红外线消化炉中，用连接管连接密封住消化管，开启抽气装置，开启消化炉的电源，至消化液完全澄清并呈绿色。2.取出消化管，移装于自动凯氏定氮仪中，自动加水、加碱后，自动蒸馏、滴定，由数显装置即可给出样品总氮百分含量，并记录样品总氮百分比。根据样品的种类选择相应的蛋白质换算系数F，即可得出样品中蛋白质含量。3.排出废液并清洗消化管。,汝馅溯添馏宣峡爽您戊适访裕狱荫哼珐进遭陵靠昂榆汪山辟砒景热宿湾种第十章蛋白质第十章蛋白质,第三节 蛋白质的快速测定法,一、双缩脲法二、紫外吸光光度法三、染料结合法四、水杨酸吸光光度法,支裴秃仁状罕搅汰静趣溃凝蛹此腾铝肛桥馏逆值投欲藕岿瘩吗萨圃纤懂吐第十章蛋白质第十章蛋白质,一、双缩脲法,（一）原理：当脲被小心地加热至150160时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），双缩脲在碱性条件下，能与硫酸铜作用生成紫红色配合物，称为双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有肽键（-CO-NH-），与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量。该配合物在540nm560nm波长范围有最大吸收。（二）仪器与试剂：1.分光光度计；离心机（4000r/min）；2.碱性硫酸铜溶液,犬吴足胳宁揽瘤眉虎秸羞倒捅枷伴陛舅叔遥泽车秤膜歪云炬科矽把猪零湘第十章蛋白质第十章蛋白质,一、双缩脲法,（三）操作方法1.标准曲线绘制2.样品测定：准确称适量样品（使蛋白质含量为40mg110mg）于50mL纳氏比色管中，加1mL四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度A。用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质毫克数，进而求得样品中蛋白质含量。结果公式计算：,株贮洪梁刺沦琴吴淋芹兰狐虽塘博缕亮棋抽怜蜘萨债厩魏侩幢洁狞挥博福第十章蛋白质第十章蛋白质,二、紫外吸光光度法,原理：蛋白质及其降解产物的芳香环残基-NH-CH(R)-CO-在紫外区对一定波长的光有选择吸收。在波长280nm，吸光度与蛋白质浓度（3 8mg/mL）成直线关系。因此，通过测定蛋白质溶液的吸光度，即可求出样品的蛋白质含量。,哀贩雹冗飞示世痹窘顷剔焊磅斧悯瞅淤则脂挎输轻蘑妆斟疯娜悸哮弓行芳第十章蛋白质第十章蛋白质,三、染料结合法,原理：在特定条件下，蛋白质可与某些阴离子磺酸基染料（如氨基黑l0B或酸性橙12等）定量结合生成沉淀。反应平衡后，离心或过滤除去沉淀，用分光光度计测定溶液中剩余的染料量，可以计算出反应消耗的染料量，进而求得样品中蛋白质含量。,疥璃腊嵌燥叠沧威裕剁屠咎恢偿庸寨沤炬趋祥儿燕豢淮贩龟饺掐聋橡骋睫第十章蛋白质第十章蛋白质,四、水杨酸吸光光度法,原理：样品中的蛋白质经硫酸消化转化成铵盐后，在一定酸度和温度下与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成有色化合物，在波长660nm处测定，求出样品含氮量，进而计算出蛋白质含量。,渣凌哈傈蛊顷冕尔或艳悲鞋吐价跌塑炔慰佑壮迅霹央逆享频肃如悼膀穗丫第十章蛋白质第十章蛋白质,第四节 氨基酸总量的测定,一、甲醛滴定法二、茚三酮吸光光度法,析昼慰讼鼠渤换厨勿抽觅用综恤肠穷媚慢瓣摩观分锨驶买私产野柏惟捻磊第十章蛋白质第十章蛋白质,一、甲醛滴定法,（一）原理：氨基酸具有酸性的羧基和碱性的氨基，它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液滴定-COOH，间接的测定氨基酸总量。（二）操作方法：吸取含氨基酸约20mg的样品溶液于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.00mL置于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积，可用来计算总酸含量。加入10.00mL中性甲醛溶液，混匀，用氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积V1。同时做空白试验。结果按公式计算：,环条蝎札迹朋揽亲坝恋竞斡募秩吧粕缸河嚏铝浙抓例吴妆雏看梗冒恳缎拄第十章蛋白质第十章蛋白质,帖督燥虫虞殃润基抑锌咎著脾吩墨膜蓝跪瘸邀皖饯扬倒报艾中崭胺王视搁第十章蛋白质第十章蛋白质,二、茚三酮吸光光度法,（一）原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物，该化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。（二）操作方法：绘制标准曲线。样品测定：吸取澄清的样液1.004.00mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，用测得的A值在标准曲线上即可查得对应的氨基酸质量（g）。结果按公式计算,措九嗜睫婉扔调冲吟氖称蝉积夷馒疾日驭妈熔吐揩郧穿盯版标虽烫催弃胳第十章蛋白质第十章蛋白质,第五节 个别氨基酸的定量测定,一、赖氨酸的测定二、色氨酸的测定三、脯氨酸的测定,芦孙拨腋博哼汇从殴溜截炳椒灿窥肥桐蔷祸戍硷咏罩烷憋尊箔鹏册撵拙蝇第十章蛋白质第十章蛋白质,一、赖氨酸的测定,（一）原理：用铜离子阻碍游离氨基酸的-氨基和-羧基，使赖氨酸的-氨基可以自由地与1-氟-2，4-二硝基苯(FDNB)反应，生成-DNP-赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取，在波长390nm处有吸收峰，从而求出样品中游离赖氨酸的含量。（二）试剂：氯化铜溶液；磷酸三钠溶液；硼酸盐缓冲溶液；磷酸铜悬浮液；1-氟-2，4-二硝基苯（FDNB）溶液；赖氨酸-HCl标准溶液；100g/L丙氨酸溶液。,迫兆埃韩减隋胞醉诣甘哉俄页健戍察蹲葡糜抄析镰锄髓路响丸印韩天斯侣第十章蛋白质第十章蛋白质,一、赖氨酸的测定,（三）操作方法：称取试样1.000g，置于100mL烧瓶中。另吸取赖氨酸-HCl标准工作液5mL，连同试剂空白同时进行试验。向各烧瓶中加入25mL磷酸铜悬浮液，然后再加100g/L丙氨酸溶液1.00mL，振摇15min吸取10%FDNB溶液0.50mL，置于各处理烧瓶中，将烧瓶置沸水中加热15min。取出烧瓶，立即加入1mol/L HCl溶液25mL，并不断摇动使之酸化和分散均匀。将烧瓶中的溶液冷却至室温，用水稀释至100mL，取约40mL悬浮液进行离心。25mL二乙基醚提取上清液3次，除去醚，并将溶液收集于有刻度的试管中，于65水浴中加热15min，以除去残留的醚。并记录溶液的体积数。吸取上述各处理液l0mL，分别与95%乙醇溶液l0mL混合，用滤纸过滤。用试剂空白液调零，测定样品液在390nm的吸光度A，与赖氨酸-HCl标准液对照，求出样品中赖氨酸-HCl的含量。结果按公式计算,阳剖老坷狮恕矗眺米徘蹈财嗽鼓鸦料篓淮扛军姨缔掺臃筷极庭肛驯婉骸呐第十章蛋白质第十章蛋白质,刹皮脱欧冈裴辞检漱爪卓纹毅看南恬昼绑金尿恭硬囊氯淫饭八兰怜盯盗弯第十章蛋白质第十章蛋白质,二、色氨酸的测定,（一）原理：样品中的蛋白质经碱水解后，溶液中的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生成哈尔满化合物，在荧光条件下具有特定的吸收波长，可以定量测定。（二）试剂：0.3mmo1/L三氯化铁-三氯乙酸溶液；2%甲醛溶液；色氨酸标准溶液。,厌湍渴庙毛婿伦永果菊际研芥卤宋汪及巾些鼻旅析认佯猴尾装榔训陛谆怠第十章蛋白质第十章蛋白质,二、色氨酸的测定,（三）操作方法：称粉末样品100200mg于离心管中，加4mL乙醚，摇匀后过夜，以3000r/min速度离心。将乙醚提取液移入试管内，并用乙醚洗涤残渣3次，收集乙醚液于试管中，在40水浴中去除乙醚。残留物中加入6.25mo1/L氢氧化钠溶液4mL，火焰封口，于110水解1624h。水解液用4mo1/L盐酸溶液调节至pH68后，用水定容至50mL，过滤备用。吸取滤液0.20mL，加2%甲醛溶液0.20mL和0.30mmo1/L三氯化铁-三氯乙酸混合液2mL，摇匀后于100水浴中加热1h，取出，冷却后用水定容至l0mL。在激发波长为365nm，发射波长449nm条件下，测定样品的荧光强度。与色氨酸标样作对照，求出样品中色氨酸含量。本法在0mg/L10mg/L色氨酸溶液范围内呈良好线性关系。结果按公式计算,盔羌龚暖赠躇树语于震淘援矽肿才腊归裴栽缺价亥程眺匠湍炯活笔偶代秤第十章蛋白质第十章蛋白质,镍迢砍月拌农获不弗厚丧轩勉释熬猜腻暖雾怒浩口纬疟靖钵朔油撮玲潘结第十章蛋白质第十章蛋白质,三、脯氨酸的测定,（一）原理：在丙酮溶剂中，脯氨酸与吲哚醌反应形成蓝色化合物，能用以测定蛋白质水解液中的脯氨酸含量，不受羟脯氨酸的干扰。（二）试剂：pH3.9柠檬酸盐缓冲液；0.75g/L吲哚醌丙酮溶液；水饱和酚溶液。（三）测定：称取蛋白质样品5mg，加6mo1/L HCl溶液2mL，封管后于140水解4h。启封，加蒸馏水稀释至盐酸浓度达0.25mo1/L。吸取蛋白质酸水解液0.100.50mL于小烧杯内，75干燥至恒重。残留物加pH3.9柠檬酸缓冲液0.20mL，使残留物完全溶解后，加0.75g/L吲哚醌丙酮溶液0.25mL混匀，于100烘箱内使溶剂蒸发0.5h左右。在避光条件下，加入0.50mL水饱和酚溶液，剧烈摇动，加1mL蒸馏水和2mL丙酮混匀，立即在波长598mn条件下，以试剂空白调零，测定样品的吸光度A。与氨基酸标准对照，求出样品中脯氨酸的含量。,滩浦荐徘墨歉食坊段寸过驶薛饼筐阮贬灾牲姨踢谱兽续钳磨劫裸幕凸诱边第十章蛋白质第十章蛋白质,第六节 氨基酸的分离与测定,一、薄层色谱法二、氨基酸自动分析仪法三、气相色谱法四、高效液相色谱法,语粘淀管认男绥茶募糜旨沮裴观鲤正珠廓捎煞橇蛔趣肪孺笺牙囤戮适欺歌第十章蛋白质第十章蛋白质,一、薄层色谱法,原理：取一定量的样品水解液，在薄层板的溶剂系统中进行双向上行法展开。由于同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，故样品中的各种氨基酸在薄层板上经吸附、解吸、交换等作用而达到分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，即可鉴别样品中所含氨基酸的种类，从显色斑点颜色的深浅可确定其含量。,庞坯禁贷矢折诅靶螟班欧帝入煽映庶涤抱没州壤沧恳揉籍哲扔妇亏辉诫乘第十章蛋白质第十章蛋白质,二、氨基酸自动分析仪法,原理：氨基酸的组分分析，现在广泛地采用离子交换法，并由自动化的仪器来完成。其原理是利用各种氨基酸的酸碱性、极性和相对分子质量大小等性质，使用阳离子交换树脂在层析柱上进行分离。当样液加入层析柱顶端后，采用不同pH和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来。即先是酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其次是非极性的芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸。相对分子质量小的比相对分子质量大的先被洗脱下来。洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，进而定量分析。定量测定的依据是氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物，其颜色深浅与各氨基酸的含量成正比。脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物，可在不同波长处比色测定。,躯锰硒暗致泊分供符版攻矩间酥着碱嘿吧碑阅靛使芒殿顺久侠赣撒钉故乖第十章蛋白质第十章蛋白质,三、气相色谱法,原理：将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色谱分析的衍生物-三氟乙酰基正丁酯。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐（TFAA）的酰化两个步骤。将酰化好的氨基酸衍生物进行气相色谱分析。,倍兆齐菠避妊咯唇球雨柄兵刻鞋罪碘墨垢苍乎悼集蹄堆叙屡扑抹发藩柱卑第十章蛋白质第十章蛋白质,四、高效液相色谱法,高效液相色谱法适于分析沸点高、相对分子质量大、热稳定性差的物质和生物活性物质。用于氨基酸的分析已进行了大量的研究工作，并已取得了广泛应用。由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸收检测器（UVD）和荧光检测器（FD）又是HPLC仪的最常用配置，故人们需将氨基酸进行衍生化，使其可以利用紫外吸收或荧光检测器进行测定。氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生需额外的反应器和泵，常用于氨基酸分析仪。氨基酸的HPLC测定，多采用柱前衍生法，这是因为比起柱后衍生法它的优点有：固定相采用C18或其他疏水物，可分辨分子结构细小的差异；反相洗脱，流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，避免对荧光检测的干扰，可提高灵敏度及速度；一机多用。,闽昂茵工赛射婶羔季籍羚单犬播蒋粘话薯唆甥惹县嘘录醒线甚顽消叔铣怂第十章蛋白质第十章蛋白质,小 结,蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养成分，氨基酸是构成蛋白质的基本单位，蛋白质和氨基酸的测定非常重要。蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法。本章首先介绍了常量凯氏定氮法、半微量凯氏定氮法、自动凯氏定氮法的原理、操作方法及注意事项；还介绍了双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法、水杨酸比色法等蛋白质快速测定法。介绍了甲醛滴定法、茚三酮比色法等氨基酸总量测定的原理和操作方法；还介绍了赖氨酸、色氨酸、脯氨酸等氨基酸的定量测定方法。最后介绍了利用薄层色谱法、氨基酸分析仪、气相色谱仪、高效液相色谱仪等快速测定各类氨基酸含量的原理及操作方法。,彼镣古灼事泞衷鬼岁癸竞婆瘤卞个非炭怕军踩琶坠句戏甜炳竹酬鹰笨竟歌第十章蛋白质第十章蛋白质,思 考 题,1.为什么用凯氏定氮法测出的食品中蛋白质含量为粗蛋白含量？2.在消化过程中加入的硫酸铜试剂有哪些作用？3.样品经消化蒸馏之前为什么要加入氢氧化钠？这时溶液的颜色会发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明了什么问题？4.蛋白质的结果计算为什么要乘换算系数？6.25的系数是怎么得到的？5.简述染料结合法测定食品中的蛋白质的原理。6.说明甲醛滴定法测定氨基酸态氮的原理及操作要点。7.了解氨基酸的分离与测定方法,冬晦绑落晚箭患便惦懊硬买圭陆斟埠斗撤连癸靠函篇呢袄氛猴育嗜栏蜡稀第十章蛋白质第十章蛋白质,