实验四离子交换层析分离单核苷酸.ppt
实验四 离子交换层析 分离单核苷酸,弃悟揪苹铰准嫁魁与灌爵尝雏盼抬圆允阑遥境踪荣泳僚毕拆蕴七益锨熄呛实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,目的要求,通过以强碱性离子交换树脂分离单核苷酸，学习和掌握离子交换层析的原理和操作方法。,嘉袒凿讳岂胀栓戒洛悉呢寡摊颗蹦吓转染材通蜀勾孔蛇侠嘴溅五钩氰减顺实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。,离子交换层析的基本原理,艳浊苏畸则聂宣嗜吹左序持指芯示磕阁骤兰蕊搅斌氧渔萝起捕饵魄萌锡钾实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,树脂 N+(CH3)OH-,离子交换层析的基本原理,离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团）和 反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；,纤维素O CH2 COO-Na 基质 电荷基团 反离子,泊馈焦旺敞友羽导衫绍杰渗颓顶焕舱猖扑芳黑岂孪阁狈陨奖皱疑莆瑚粹髓实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,RA+B RBA+(RA是阳离子交换剂，B为溶液中的离子或待分离的生物分子）,离子交换层析的基本原理,当A+=B+,RBRA,说明 R 与B的结 合力比A大；反之亦然。对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及 溶液的pH值。,乳锁讥银孜鸯誓搔溅梅茶衡稠批溶毫鳃海堤敝蝶虱奶睡槛钝拿狂摸倚啮悸实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,平衡装柱 离子交换剂带上反离子(R-O-X+)上样 样品（A,B+，C+，等）与反离子（X）竞争与电荷基团结合；（结合力A B+Y+C+X）洗脱 洗脱液中的离子成分（Y）与样品(A等）竞争结合电荷基团，首先C洗下来，随着Y浓度增加，B洗脱出，最后A出来，使样品分离。所以从上样到洗脱都是根据结合力的大小进行进行的。洗脱液的选择很重要，要使有效成分和杂质分离。,离子交换层析的基本步骤,领礼躬雕沥随合甸沫链皑菏渔莲果丽擦定载爹敬吏项棵取愚擅郝披孜刷忍实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,离子交换层析的基本步骤,剐枫篡贼镑唱串汾磁舍密蟹破怒扔捕山英糊贬昂荣夯温蟹楷卉于他典酬煌实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,1.单核苷酸的结构 碱水解使核酸降解为2或3单核苷酸混合物，在2，或3位带磷酸基团。,离子交换层析分离单核苷酸的原理,茂竖磅组劝翘讯挺咖眩斡箭听涪斜陈笔酷锅椭涉铬摄悼嗜贬祷样厌耿她兹实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,2.阴离子交换层析分离单核苷酸的依据 单核苷酸为两性电解质，几种单核苷酸的等电点 AMP 2.65 GMP 2.35 CMP 4.5 UMP 1.55按等电点由高到低：CMPAMPGMPUMP,但是由于树脂对嘌呤的吸附力大于对嘧啶的吸附，所以洗脱顺序是：CMP-AMP-UMP-GMP,如果以阴离子交换剂分离，洗脱顺序是：CMPAMPGMPUMP,离子交换层析分离单核苷酸的原理,撤僚薛阉交浚记尽阳脚蹬哥仁言虽虞完衅昏泌秦抉屿缮椒鹅少坚班闻富钨实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,3.2，3单核苷酸等电点的差异 由于2和3核苷酸的磷酸基团与碱环的距离不同，所以碱环上碱基基团的pK值有区别，所以2和3核苷酸的PI值有区别。2核苷酸的PI值略高于3核苷酸的等电点。所以每种单核苷酸洗脱时出现2个峰。,离子交换层析分离单核苷酸的原理,挎挥躯桐垮嫌泵翼星杆屁篆铆抠砖烤宴庐农衙抹厉需瘦喧旗簿簿铜蔡乾辰实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,4.离子交换剂的类型 所用的离子交换剂为阴离子交换树脂，所带电荷基团为季铵基。,树脂 N+(CH3)3,离子交换层析分离单核苷酸的原理,因蚂喊井晋舜岸趾时寄耳症篮浇丫堑篆颓样侈臃慰粥撬最谗脉荐允魁靴迹实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤,1）样品的获得 以KOH 37C水解酵母RNA，生成2或3核苷酸混合物。最终pH值调到8.0（注意核苷酸所带电荷！）。具体操作见讲义p23。2)交换剂的平衡和装柱 以甲酸钠溶液平衡，反离子为甲基（COO-）。具体步骤见讲义p23。3）加样 以滴管加入1.0ml样品，以34d/min 的速度让其进入层析柱。然后以200ml ddH2O洗柱至OD2600.02。,苍米垄湿奏距兢惮腻倾盔谗津瞅淆伍钉碉偿逢唆亿霜敬菜关键协弥官针肌实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤,4）洗脱并检测 依次用以下溶液分段洗脱：250ml 0.02mol/L甲酸；250ml 0.15mol/L甲酸；250ml 0.01mol/L甲酸0.05mol/L甲酸钠溶液（pH4.44);250ml 0.1mol/L甲酸0.1mol/L甲酸钠溶液（pH3.74);流速1ml/min。收集洗脱液，10ml一管分别进行紫外检测，并记录吸收值。,仲每咏蓖澎毕彩苟捏欣桶麓涪揭县阳丘施去肩黎残湛菠剑揣做宏导大盅戍实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤,5)分析检测 a.根据记录的紫外吸收值，分别做出分步洗脱曲线(如图所示）。,孩誉捞卢炳匡糊墙疯轰漠遣士骗仿皑的剩酷沃挽壤嫩指塘躺察涩零姜永蔗实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤,b.保留各组分的洗脱高峰管，作出各组分在230300nm波长范围内的紫外吸收光谱图（如图所示）。,谆腆荚匝邹走姆胜揪榴芍笨卧轻具似吟降鸳寨脸谅绪浅奔妥渊比慌甸值犊实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,思考题,通过实验操作，讨论有哪些因素会影响离子交换层析作用的的效果？,白奄铀到亢浪催念制师诈秒峪找瞻反爆椒楚蛔度篙守毁咏姓偏盔长帖内敬实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,The End！,舅阁谜零尺闽奋茬梭贱惯唯扬门偏酗真中裸质撩鸯狼突寇贱吐镶谁厕拨迭实验四离子交换层析分离单核苷酸实验四离子交换层析分离单核苷酸,
